中药注射剂类过敏反应临床前评价动物品系和性别差异研究Word文档格式.docx

中药注射剂类过敏反应临床前评价动物品系和性别差异研究Word文档格式.docx

《中药注射剂类过敏反应临床前评价动物品系和性别差异研究Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《中药注射剂类过敏反应临床前评价动物品系和性别差异研究Word文档格式.docx（8页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

性别差异;

动物模型

　　PreclinicalevaluationofpseudoallergicreactionsonChineseherbalinjections：

　　studyonanimalstrainandgenderdifference

　　ZHANGYu-shi，YIYan，LIChun-ying，ZHAOYong，WANGLian-mei，HANJia-yin，LUYu-ting，TIANJing-zhuo，

　　FENGXiao-yi，LIGui-qin，LIANGAi-hua*

　　（InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，KeyLaboratoryof

　　BeijingforIdentificationandSafetyEvaluationofChineseMedicine，Beijing100700，China）

　　[Abstract]Pseudoallergicreactionsoccuredafterthefirstadministrationofpatients，andthepathogenicmechanismsofthemweredifferentfromtheallergicreactionswhichneededexcitationafterantigensensitization.Toprovideabasisforevaluation，clinicaluseanddrugdevelopmentofpseudoallergicreactions，themodelswereestablishedbytwokindsofChineseherbalinjections（CHI）bothondifferentstrainorgendermice.WiththeuseofICR，Kunming，BALB/C，C57mice，pseudoallergictestsoftwoCHIwereconductedtocomparethesensitivityoffourstrainsmice，andcomparedthedifferencesinmaleandfemaleanimals.Testsubstancescontain0.8%Evansblue（EB）wereintravenouslyinjectedintodifferentstrainandgendermice.ScoresofearbluestainingandquantitationofearEBexudationweretheparametersforpseudoallergicreaction.ResultsofstraindifferenceindicatedthatbothCHIAandBcouldcauseseverepseudoallergicreactionsindicatedbyobviousvascularhyperpermeabilityonICRmice.ThepseudoallergicreactionsinICRmicearemoreobviousunderthethesamedoseofinjection，whichstatedthesensibilityofICRmice.AndthereactionsofKMmiceandBALB/CmicewereslightlyreducedwhichcomparedtoICRmice，evenalomostnothingonC57mice.ComparisonresultsofgenderdifferenceshowedthatoneCHIwasnothavesignificantdifferenceinmaleandfemaleanimals，butmaleanimalsweremoresusceptiblethanfemalesonanotherCHI.Therefore，ICRmicewerepreferableexperimentalstrainonthemodelofpseudoallergicreactionsinducedbyCHIAandB.Becauseoffemaleanimalswereeasilyinfluencedbyestrouscycle，thepseudoallergicreactionsinducedbyCHIAandBselectandusemalemicebefittingly.　　[Keywords]pseudoallergicreaction;

Chineseherbalinjections;

straindifference;

genderdifference;

animalmodel

　　doi：

10.4268/cjcmm20151407

　　中药注射剂是我国创新型的一类药物，由于其生物利用度高、作用迅速等特点已被广泛应用于临床，在许多中医常见病及疑难杂症的治疗上取得良好的疗效&

lt;

sup&

gt;

[1]&

/sup&

。

但中药注射剂成分较为复杂，随着临床中药注射剂的广泛应用以及药物不良反应监测在我国的逐渐开展，由中药注射剂引发的药物不良反应报导逐渐增多，安全性问题越来越突出，不但阻碍了中药新药研发的步伐，也制约了现有品种的应用&

[2-3]&

在较多与中药注射剂相关的“过敏反应”报道中，有不少患者的“过敏反应”是在首次用药后发生，与过敏反应需要抗原致敏后再次激发2个阶段的致病机制不同。

结合课题组前期研究，作者认为很多病例可能并不是真正的过敏反应，而是类过敏反应。

本研究利用前期已经建立的类过敏实验动物模型&

[4]&

，选择临床报道有较多不良反应的中药注射剂A，B为代表，分别对其是否诱发类过敏反应及动物品系、性别差异对类过敏反应的影响进行探讨，从而为中药注射剂的现有品种的类过敏反应评价、临床使用及新药研发提供参考。

　　1材料

　　1.1动物健康成年ICR小鼠（雌雄各半），BALB/C、昆明和C57小鼠（雄性），SPF级，体重23～25g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012-0001。

在屏障系统内饲养，温度控制在20～25℃，相对湿度40%～70%，人工12h明暗周期，每小时通风15次。

　　1.2药品和试剂2种中药注射剂（A，B，批号分别为1205110，1301311）;

组胺（国药集团化学试剂有限公司，批号F20090423）;

伊文思蓝（EB）（国药集团化学试剂有限公司，批号W20110325）;

甲酰胺（国药集团化学试剂有限公司，批号F20110915）;

生理盐水（NS）（石家庄四药有限公司，批号1302171602）。

　　2方法

　　2.1剂量选择注射剂A在临床上人用剂量为60mg?

kg-1，按照体表面积折算为小鼠等剂量为600mg?

kg-1。

注射剂A选择临床等效剂量600mg?

kg-1作为小鼠用药高剂量，在此基础上等倍稀释（300g?

L-1）作为低剂量。

注射剂B在临床上人用剂量为一次50～100mL，按60kg人体重计算，换算约为0.83～1.67mL?

kg-1，换算成小鼠等倍剂量约为7.5～15mL?

本研究中注射剂B选择2个剂量，分别为10，5mL?

　　2.2试验方法本研究中采用伊文思蓝（EB）作为指示剂，与中药注射剂同时静脉注射后，如果有类过敏反应发生，则血管的通透性会增高，EB就会渗出到血管周围的组织中使得组织蓝染，反应越重蓝染面积和蓝染程度越重。

因此，通过观察给药后小鼠耳廓蓝染情况来评价中药注射剂是否具有引起类过敏反应的潜在作用。

　　参照我国《中药、天然药物免疫毒性（过敏性、光过敏反应）研究的技术指导原则》（[Z]GPT5-1），将各品系小鼠均按照体重分成阴性对照组、阳性对照组、中药注射剂高、低剂量组。

阴性对照组经尾静脉注射用生理盐水配制的EB溶液80mg?

kg-1;

阳性对照组经尾静脉同时注射组胺10mg?

kg-1和EB溶液80mg?

中药注射液各剂量组分别尾静脉同时注射不同剂量的中药注射剂和EB溶液80mg?

各组均给药1次，给药体积10mL?

给药后30min内，观察动物的耳廓蓝染情况。

根据每组出现耳廓蓝染的动物数计算反应率=出现耳廓蓝染的动物数/组内动物数×

100%;

耳廓蓝染面积（S）按照以下标准进行分级：

0分，双耳无蓝染;

1分，0<

S≤1/8（蓝染面积占耳廓面积的1/8，以下相同）;

2分，1/8<

S≤1/4;

3分，1/4<

S≤1/2;

4分，1/2<

S≤3/4;

5分，3/4<

S≤1。

于评分完毕后，将动物脱颈椎处死。

沿耳根剪下双耳，剪碎，用甲酰胺溶液37℃避光浸泡48h，萃取耳廓内渗出的EB染料。

用200目筛网过滤除去组织碎片，取滤液加入到48孔板中，每孔1mL。

用酶标仪（Thermo，型号Varioskanflash，美国）于610nm处测吸光度（A）。

根据伊文思蓝标准曲线，计算伊文思蓝染料渗出量（μg）。

结合耳蓝染面积与EB渗出量来评价类过敏反应程度，以反应指数表示（等于耳蓝染平均分值×

EB渗出增高率/100）。

反应指数≥1.5评价为类过敏反应阳性;

反应指数&

1为类过敏反应阴性;

当反应指数为1～1.5时定评价为不确定或可疑。

　　2.3统计分析小鼠各组的EB渗出数据和其他各项指标均以±

s表示。

采用One-WayANOVA进行分析。

根据每组发生耳廓蓝染的动物数计算各组血管反应阳性率（简称反应率）;

率的统计采用Fisher精确概率法检验;

耳廓蓝染面积评分采用非参数检验。

所有统计分析均以P&

0.05为有显著性差异。

　　3结果

　　3.1不同品系小鼠对中药注射剂A的类过敏反应ICR，BALB/C，昆明和C57小鼠的阴性对照组在静脉注射EB生理盐水溶液后均没有出现耳廓蓝染，说明EB生理盐水静脉注射后未引起以血管通透性增高为表现的类过敏反应。

ICR，BALB/C，昆明小鼠在静脉注射组胺和EB后，耳廓明显蓝染，蓝染面积评分以及组织中的EB渗出量均显著增高，反应指数提示有明显类过敏反应发生;

而C57小鼠静脉注射组胺后只有部分小鼠出现非常浅和范围很小的蓝染，并且组织中的EB渗出量较低，反应指数均未超过1，提示类过敏反应不明显。

上述结果提示C57小鼠对组胺不敏感。

　　在上述4种品系小鼠中，ICR小鼠和昆明小鼠在给予中药注射剂A高剂量后显现了明显的类过敏反应，其中ICR小鼠敏感性更高，其耳蓝染评分的分值较高，EB渗出量较对照组显著增高。

BALB/C和C57的敏感性较低，高剂量水平在BALB/C小鼠有部分动物产生很小和很浅的蓝色，耳蓝染评分分值和EB渗出量均很低，按照反应指数评价为阴性;

高、低剂量在C57小鼠上未见耳廓蓝染发生。

结果表明，采用C57，BALB/C小鼠进行中药注射剂A的类过敏试验时敏感性太低，不宜选用;

ICR，昆明小鼠敏感性较高，2种动物均可选用，其中ICR小鼠的敏感性更高，见表1。

　　3.2不同品系小鼠对中药注射剂B的类过敏反应注射剂B高、低剂量在ICR小鼠上均引起了明显的血管通透性增高，产生了明显的类过敏反应，反应指数均高于1.5，反应程度与剂量呈正比例。

高剂量在昆明和Balb/c小鼠上可引起明显的类过敏反应，2种动物产生的类过敏程度相近，但均比在ICR小鼠产生的类过敏反应程度轻;

低剂量在这2种动物上使部分动物耳廓出现很浅的蓝染，组织中EB渗出量增高不明显，反应指数较低，类过敏反应不明显。

C57小鼠的敏感性较低，高、低剂量水平在C57小鼠上耳廓蓝染程度很轻，类过敏反应不明显。

结果表明，C57小鼠敏感性低，不宜用于中药注射剂B的类过敏试验。

ICR的敏感性最高，宜用于中药注射剂B的类过敏试验。

昆明、Balb/c小鼠的敏感性中等，2种动物可检测出较高剂量下的类过敏反应。

4种小鼠对中药注射剂B类过敏反应的敏感性为：

ICR&

BALB/C&

昆明&

C57小鼠，见表2。

　　3.3中药注射剂A小鼠类过敏反应的性别差异阳性对照组（组胺）在雄性和雌性ICR小鼠上均发生了明显的耳廓蓝染，但雄性小鼠对组胺的类过敏反应比雌性小鼠强。

从中药注射剂A高、低剂量组的耳蓝染评分、EB渗出量以及反应指数等指标上分析，雄性小鼠的类过敏反应比雌性动物的反应强，说明雄性动物更敏感，见表3。

　　3.4中药注射剂B小鼠类过敏反应的性别差异阳性对照组（组胺）在雄性和雌性ICR小鼠上均发生了明显的耳廓蓝染，但雄性小鼠对组胺的类过敏反应比雌性小鼠强。

从中药注射剂B高、低剂量组的耳蓝染评分、EB渗出量以及反应指数等指标上分析，雄性小鼠和雌性小鼠对中药注射剂B的类过敏反应相近，说雌、雄性动物对中药注射剂B的敏感性相近，见表4。

　　4小结和讨论

　　中药注射剂类过敏反应的机制复杂，其症状与I型过敏反应（即IgE介导的过敏反应）的症状相似，严重者可引起休克甚至死亡。

I型过敏反应包括致敏原进入机体后使机体处于致敏状态，当机体再次接触此致敏源后产生激发反应2个阶段，属于IgE介导的抗原抗体反应&

[5-6]&

而类过敏反应的机制并不十分清楚，现有的观点认为，类过敏反应不是特异性免疫（IgE）介导的，而是致类过敏物质首次进入机体内直接刺激肥大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒并释放组胺和致敏介质及激活补体从而释放上述生物活性物质有关&

[7-8]&

　　血管通透性增高是类过敏反应的主要病理机制之一。

通透性增高可以使血浆渗出水肿并伴发相关炎性反应，从而导致皮肤红肿、瘙痒、胃肠道不适、呼吸困难等症状，严重者可导致血容量下降，引起血压下降甚至休克等&

[9]&

本课题组前期以血管通透性增高为指标建立了一种注射剂小鼠类过敏反应模型&

，即在注射剂受试物中加入伊文思蓝溶液，通过耳廓蓝染率和耳廓面积分级，判断血管通透性增高的程度。

　　在本研究中，通过首次尾静脉注射给予含有EB的2种中药注射剂A和B，观察给药30min内各组小鼠的耳廓蓝染情况，比较其是否能够诱发ICR，BALB/C，昆明和C574种不同品系小鼠的类过敏反应及不同品系之间的差异，以判断何种品系小鼠更适于此方法预测其类过敏反应的发生。

结果显示，C57小鼠、BALB/C小鼠对2种中药注射剂敏感性较低，给药后产生的类过敏反应不明显，故进行中药注射剂的类过敏反应检测时，不建议选用C57和BALB/C小鼠。

在2种中药注射剂类过敏反应检测中，ICR、昆明小鼠均显示有较高的敏感性，其中ICR的敏感性更高，故认为二者均可用于中药注射剂的类过敏试验，其中可首选ICR小鼠。

目前，在很多不同的动物实验中，由于近交系小鼠基因型高度纯合，均能表现出很好的稳定性，大大降低了个体差异带来的实验误差。

因此近交系小鼠作为大部分生命科学实验的首选实验小鼠，但这并不意味着在所有的实验中近交系都优于远交群。

本研究发现了中药注射剂类过敏反应检测模型存在着品系差异，即远交群小鼠（ICR和昆明）表现出对类过敏反应较为敏感，而近交系小鼠（BALB/C和C57）敏感性相对较差。

可能与近交系小鼠是通过同胞兄弟姐妹连续交配20代以上建立起来相关，但其中具体的生物学机制，还需要进一步的研究。

　　性别差异结果显示，中药注射剂A等倍剂量在雄性小鼠上产生明显的通透性增高即诱导发生了类过敏反应，而在雌性小鼠的反应与雄性小鼠相比明显减弱（P&

0.05），说明雄性小鼠较为敏感;

临床等倍和1/2倍浓度的中药注射剂B在雄性和雌性小鼠上均诱导发生了明显的类过敏反应，而雌性小鼠与雄性小鼠相比类过敏反应较弱，亦说明雄性小鼠较敏感。

中药注射剂A和B诱导的血管通透性增高结果均提示雄性小鼠较雌性小鼠易发生类过敏反应，推测有可能是雌性小鼠存在雌性激素的影响。

另外由于雌性动物易受动情周期影响的原因，故进行中药注射剂A和B的类过敏试验时，宜选用雄性小鼠，但根据实验的需要也可选取雌性小鼠进行检测。

虽然本研究发现了中药注射剂类过敏反应模型存在雌雄差异，但未能明确其中的机制，还需要进一步的研究。

　　本研究针对中药注射剂类过敏反应中的品系和性别因素进行了一些初步探索，为后续的研究打下坚实的基础，也为其他品种的中药注射剂类过敏反应提供判断依据。

　　[参考文献]

　　[1]钱钦.中药注射剂不良反应发生原因及防治措施分析[J].中国医药科学，2014，4（18）：

79.

　　[2]刘滢.中药注射剂不良反应中的不合理用药分析[J].西部中医药，2014，27（7）：

57.

　　[3]谭乐俊，王萌，朱彦.中药注射剂的不良反应研究进展[J].中国中药杂志，2014，39（20）：

3889.

　　[4]梁爱华，李春英，易艳，等.药物类过敏反应的临床前评价方法研究（I）――小鼠类过敏反应评价方法的建立和验证[J].中国中药杂志，2012，37（13）：

1865.

　　[5]LeeC，GianosM，KlaustermeyerWB.Diagnosisandmanagementofhypersensitivityreactionsrelatedtocommoncancerchemotherapyagents[J].AnnAllergyAsthmaImmunol，2009，102（3）：

179.

　　[6]CastellsM，delCarmenSancho-SerraM，SimarroM.Hypersensitivitytoantineoplasticagents：

mechanismsandtreatmentwithrapiddesensitization[J].CancerImmunolImmunother，2012，61（9）：

1575.

　　[7]RomanoA，TorresMJ，CastellsM，etal.Diagnosisandmanagementofdrughypersensitivityreactions[J].JAllergyClinImmunol，2011，127（3）：

S67.

　　[8]SzebeniJ，MuggiaF，GabizonA，etal.Activationofcomplementbytherapeuticliposomesandotherlipidexcipient-basedtherapeuticproducts：

predictionandprevention[J].AdvDrugDelivRev，2011，63（12）：

1020.

　　[9]NagyJA，BenjaminL，ZengH，etal.Vascularpermeability，vascularhyperpermeabilityandangiogenesis[J].Angiogenesis，2008，11

（2）：

109.

　　[责任编辑张宁宁]