碳纳米管组装血红蛋白的直接电化学Word文件下载.docx

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指导老师:

缪谦

一、研究背景（前言）

近来，氧化还原型蛋白与电极之间的直接电子转移已引起了越来越多的关注。

它们之间的电子转移可以为实际生物系统的机理研究提供一种理想的模型，还可以对制备基于生物传感器、生物医疗设备和酶反应器等起到重要作用。

然而，三个主要的问题阻碍了蛋白与酶之间的电子转移：

（1）氧化还原中心埋藏于蛋白内部远离电极表面；

（2）蛋白质的扩散系数很小；

（3）蛋白质易强烈吸附在金属电极表面发生变性。

因而，研究主要集中在去寻找一种理想的电极材料和合适的蛋白固定方法来实现它们的直接电化学反应并保持它们的生物相容性。

碳纳米管（CNTs）自从1991年被Iijima发现后由于具有稳定的物理化学性质已经引起了相当的关注。

碳纳米管可以表现出像金属或半导体一样的电化学性质主要取决于它们的尺寸大小和晶格螺旋性。

这种精细的电化学性质决定了当它在电化学反应中被用作电极材料时，具有促进电子转移反应的能力[1]。

二、实验目的

1．了解模拟生物膜Hb-MWNT-Nafion的制备方法

2.实现血红蛋白（Hb）直接电子传递

3．学习Hb-MWNT-Nafion膜修饰玻碳电极对过氧化氢的电催化行为和催化机理

4．掌握测定血红蛋白催化过氧化氢的米氏常数的测定方法

三、实验原理

1、Hb的直接电子转移

Hb在一般固体电极的电子传递速率很低，电子传递受阻

将Hb直接吸附固定在经羧基化处理的多壁碳纳米管（MWNT）和聚四氟乙烯（氟碳聚合物）薄膜中

实现Hb的直接电子转移

2、血红蛋白对H2O2的催化

2Fe2+（ferro）+H2O2→2Fe3+（ferro）+2OH-

Fe3+（ferro）+e-→Fe2+（ferro）

ferro-卟啉

3、米氏常数的测定

（1）米氏常数（Km）

等于酶促反应达到其最大速率一半时的底物浓度[S]

表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱

（2）稳态条件下，类似于酶促反应的电催化过程，根据

Lineweaver-Burk方程可得

以1/i~1/[S]作图，利用斜率和截距可以计算出米氏常数

四、仪器和试剂

1、仪器

电化学分析仪，玻碳电极，铂丝电极，饱和甘汞电极，超声波清洗机，超纯水器，离心机，红外光谱仪，烘箱，红外灯，电子天平。

2、试剂

Al2O3抛光粉（0.3μm和0.05μm），牛血红蛋白（CP），多壁碳纳米管（直径<

10nm，长度=1~2μm，纯度>

95%），5%Nafion溶液，过氧化氢（30%，AR），硝酸（AR），K3Fe（CN）6（>

99.0%，AR），乙醇（AR），KCl（99.5%，AR），磷酸氢二钠（AR），磷酸二氢钾（AR），高纯氮气（99.999%）。

5、实验步骤

1、可溶性多壁碳纳米管的制备

称取20mg多壁碳纳米管于50mL圆底烧瓶中，加入30mL30%HNO3，在170℃回流4h后冷却至室温。

在1000~2000r/min下离心3min，分离出多壁碳纳米管，用去离子水洗涤到pH值5~6之间，置于110℃烘箱干燥1h，取出在红外灯下恒重。

红外表征，与未处理的多壁碳纳米管比较。

2、玻碳电极的预处理和循环伏安表征

预处理：

玻碳电极用0.05μm的Al2O3粉抛光成镜面，分别用无水乙醇及超纯水超声洗净，晾干。

在电解池中加入1.0mmol∙L-1K3Fe（CN）6（含0.1mol∙L-1KCl溶液），通氮气除氧15mim，以玻碳电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，以100mV∙s-1速率扫描，记录+0.6~-0.2V电位范围内的循环伏安图。

（△E<

80）

3、纳米组装血红蛋白修饰电极的制备

将1mg水溶性多壁碳纳米管，4mg血红蛋白，0.1mL5%Nafion溶液及0.9mL无水乙醇混合后超声震荡分散得黑色悬浮液。

将10μLHb-MWNT-Nafion分散液滴涂于玻碳电极（glassycarbonelectrode，GCE）表面，晾干2h得Hb-MWNT-Nafion-GCE。

以不加MWNT用相似方法制得Hb-Nafion-GCE为对照。

4、对过氧化氢的催化和米氏常数的测定

在电解池中加入10mL0.1mol∙L-1pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液，通氮气除氧15min。

加入不同溶度的过氧化氢溶液：

0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mmol∙L-1，以Hb-MWNT-Nafion-GCE为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，分别记录在100mV/s扫描速率下，从+1.0~-1.5V线性扫描图。

以Hb-Nafion-GCE为工作电极，在相同的条件下做对照试验。

六、数据处理

1.玻碳电极循环伏安表征

Hb-MWNT-GCE，△E≈70.

无羟基化Hb-MWNT-GCE，△E≈90

Hb-GCE，△E≈110

结果：

三只电极均符合表征表征

2.以1/ipc对1/[H2O2]作图，求出米氏常数

（1）Hb-MWNT-GCE（10组线性伏安图依次如下）

[H2O2]/mmol/L

Ipc/（nA）

4

2179

8

2187

12

2251

16

2254

20

2276

30

2321

40

2367

50

2883

60

2525

70

2530

以1/ipc对1/[H2O2]作图（取4~7组数据作图如下）

im=2500nAKm=0.1375

（2）Hb-GCE（12组线性伏安图依次如下）

0.50

2162

1.00

7023

1.50

3960

2.00

4047

2.50

3273

3.00

2934

3.50

2650

4.50

2912

5.50

2970

65.00

2876

75.00

2952

85.00

2994

以1/ipc对1/[H2O2]作图（取7、10、11、12组数据作图如下）

im=3333nAKm=8.3325

总结：

由结果分析，Hb-MWNT-GCE的Km小于Hb-GCE，所以Hb-MWNT-GCE与H2O2反应的亲和能力大于Hb-GCE，不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度,电催化效果更好。

七、注意事项

1、玻碳电极表面要处理干净，否则会阻碍修饰膜的电子传递。

2、缓冲溶液中的空气要彻底排除，防止氧气对过氧化氢的催化干扰。

八、结果与讨论

1.比较处理前后多壁碳纳米管的FT-IR谱图并解释水溶性原因。

答：

预处理之后，△E减小。

化学修饰后，可以增加碳纳米管的水溶性，有利于碳纳米管的溶解[2]。

2.血红蛋白修饰电极上的直接电化学行为讨论。

三个主要的问题阻碍了血红蛋白与酶之间的电子转移：

Hb-MWNT-Nafion-GCE使得血红蛋白直接吸附固定在多壁碳纳米管和Nafion薄膜中，实现血红蛋白的直接电子转移。

3.Hb-MWNT-CS和Hb-CS修饰电极对过氧化氢催化电流大小的比较及讨论。

答:

im（Hb-MWNT-CS）=2500小于im（Hb-CS）=3333nA。

纳米碳管不会使血红素蛋白质变性，同时纳米碳管的高比表面积、高活性、和具有的尺寸效应、界面效应、量子效应等特性使血红素蛋白质能够直接电化学。

4.探讨血红素蛋白质对过氧化氢的催化机理。

九、思考题

1.纳米材料在电极表面修饰层内作用和原因是什么？

作用:

纳米粒子经表面改性后，其吸附、润湿、分散等一系列表面性质都将发生变化，有利于颗粒保存、运输及使用。

原因：

（1）纳米粒子表面有大量的活性原子存在，极易吸附各种原子或分子。

（2）纳米粒子活性极大，多数金属纳米粒子在与空气接触时容易氧化甚至燃烧。

（3）纳米粒子的团聚可以减小颗粒的比表面，减小体系Gibbs自由能，降低颗粒的活性[3]。

2.试说明米氏常数Km的生物学意义

Km值是酶的特征性常数，Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；

Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。

酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。

Km值只与酶的性质、酶所催化的底物和酶促反应条件（如温度、pH、有无抑制剂等）有关，与酶的浓度无关。

酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。

十、参考文献

[1]李元军，黄富英，王飞，李艳彩.血红蛋白在SWCNTs-CTAB修饰电极上的直接电化 

学和电催化研究[J].福建省教育厅科技项目,2011,9.

[2]李含.化学修饰的水溶性碳纳米管[J].南京工业大学学报，2010,3.

[3]张万忠，乔学亮，陈建国，王洪水.纳米材料的表面修饰与应用[J].化工进展，2004,10:

1067.

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