生物技术制药课后习题Word格式.docx
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提高质粒稳定性的方法如下：
（1）选择合适的宿主细菌
（2）选择合适的载体
（3）选择压力
（4）分阶段控制培养
（5）控制培养条件
（6）固定化
7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些如何控制发酵的各种参数
影响因素：
（1）培养基
（2）接种量
（3）温度
（4）溶解氧
（5）诱导时机的影响
（6）诱导表达程序
（7）PH值
8.什么是高密度发酵影响高密度发酵的因素有哪些可采取哪些方法来实现高密度发酵
高密度发酵：
是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L
（1）培养基
（2）溶氧浓度（3）PH（4）温度（5）代谢副产物
实现高密度发酵的方法：
（1）改进发酵条件：
a、培养基b、建立流加式培养基c、提高供养能力
（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：
a、阻断乙酸产生的主要途径b、对碳代谢流进行分流c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因
（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌
9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些它们的原理是什么
方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。
（1）离子交换色谱IEC：
是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
（2）疏水层析HIC：
是利用蛋白质表面的疏水区与固定相上疏水性基团相互作用力的差异，对蛋白质组进行分离的层析方法。
（3）亲和层析AC：
是利用固定化配体与目的蛋白质之间的非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。
（4）凝胶过滤层析：
以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。
10.对由基因重组技术所获得的蛋白质药物进行鉴定时，常做哪些项目分析
基因工程药物质量控制主要包括以下几点：
产品的鉴别，纯度，活性，安全性，稳定性和一致性
项目分析主要有：
（1）生物活性测定
（2）理化性质鉴定
（3）蛋白质含量鉴定
（4）蛋白质纯度分析
（5）杂志检测
（6）稳定性考察
（7）产品一致性的保证
11.离体培养的动物细胞分为哪些类型
分为三类：
（1）贴壁细胞：
细胞生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长增殖。
（2）悬浮细胞：
细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中悬浮状态生长
（3）兼性贴壁细胞：
既可贴附于支持物表面生长，又在悬浮生长。
12.生产用的动物细胞有哪些种类它们各有什么特点
13.常用的培养动物细胞的培养基的种类有哪些
（1）天然培养基
（2）合成培养基
（3）无血清培养基
14.如何进行动物细胞大规模培养
大规模培养的方法：
（1）悬浮细胞
（2）贴壁细胞
（3）贴壁—悬浮细胞：
a、微载体培养b、包埋和微囊培养c、结团培养
大规模培养的操作方式：
（1）分批式操作
（2）半连续式操作
（3）灌流式操作
15.动物细胞生物反应器必须具备哪些基本要求有哪些类型特定是什么
动物细胞反应器具备的基本要求：
（1）制造生物反应器所采用的一切材料，尤其是与培养基，细胞直接接触的材料，对细胞必须是无毒性的。
（2）生物反应器的结构必须使之具有良好的传质、传热和混合的性能
（3）密封性良好，可避免一切外采的不需要的微生物污染。
（4）对培养基环境中多种物理化学参数能自动检测和调节控制，控制的精度高，而且能保持环境质量的均一。
（5）可长期连续运转，这对于培养动物细胞的生物反应器显得尤其重要。
（6）容器加工制造时要求内面光滑，无死角，以减少细胞或微生物的沉积。
（7）拆装，连结和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修
（8）设备成本尽可能低。
反应器类型及特点：
（1）搅拌罐式生物反应器：
主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养以及结团培养
（2）气升式生物反应器：
气体通过装在罐底的喷管进入反应器的导流管，致使该部液体的密度小于导流管外部的液体形成循环流。
（3）中空纤维式生物反应器：
占地空间小，产品产量、质量高，生产成本低，不能重复使用，不能耐高压蒸汽灭菌，需用环氧乙烷或其它消毒剂灭菌，难以取样检测。
（4）透析袋或膜式生物反应器：
可使细胞达到高密度，又可随意组合进行操作，对产品进行浓缩纯化。
（5）固定床或流化床生物反应器：
结构简单，装填材料易得。
16.动物细胞制药有哪些新进展
17.什么是单克隆抗体单克隆抗体有哪些不足
单克隆抗体：
是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的抗体。
不足：
（1）单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体，加速了排斥反应，在人体内半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间。
（2）完整的抗体分子，即Ig的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度。
18如何制备杂交瘤细胞
将两个细胞（例如B淋巴细胞和骨髓瘤细胞）通过诱导融合形成杂交细胞，具体操作时为了提高成功率会用多个细胞同时杂交，然后筛选出目的细胞，再进行细胞培养使其有丝分裂而增值，得到大量目的细胞（杂交瘤细胞）。
19．基因工程抗体有哪些类型其特性和制备方法有什么不同
基因工程抗体主要包括嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。
（1）嵌合抗体 嵌合抗体（chimericatibody）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
（2）人源性抗体是将人抗体的CDR代之以鼠源性的CDR，由此形成的抗体，鼠源性只占极少，称为人源化抗体。
（3）完全人源化抗体采用基因敲除术将小鼠Ig基因敲除，代之以人Ig基因，然后用Ag免疫小鼠，再经杂交瘤技术即可产生大量完全人源化抗体。
（4）单链抗体 是将Ig的H链和L链的V区基因相连，转染大肠杆菌表达的抗体分子，又称单链FV（singlechainfragmentofvariableregion,sFv）。
SFv穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。
（5）双特异性抗体将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起，制成双功能性抗体，称为双特异性抗体。
如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞（CTL细胞、NK细胞、LAK细胞）表面分子的抗体（CD3抗体或CD16抗体）制成的双特异性抗体，有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用。
20.抗体治疗药物有哪些
（1）放射性同位素标记的抗体治疗药物
（2）抗癌药物偶联的抗体药物
（3）毒素偶联的抗体药物
21.抗体诊断试剂有哪些类型
（1）血清学鉴定用的抗体试剂
（2）免疫标记用的抗体试剂
（3）导向诊断药物
（4）CD单克隆抗体系列
22.单克隆抗体制备的基本原理与过程有什么意义
原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。
B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。
将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。
这种技术即称为单克隆抗体技术。
过程
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。
免疫的方法取决于所用抗原的性质。
免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。
骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。
3）细胞融合的关键:
1技术上的误差常常导致融合的失败。
例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。
这必然要失败的。
2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选应尽早进行。
通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。
检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。
具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。
常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。
其中ELISA法最简便，RIA法最准确。
阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。
5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。
克隆化应尽早进行并反复筛选。
这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。
反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。
克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。
（1）显微操作法：
在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。
这种方法操作复杂，效率低，故不常用。
（2）有限稀释法：
将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。
第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。
由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。
应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都应冷冻保存，以便重复检查，避免丢失有意义的细胞。
（3）软琼脂法：
将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。
在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达到单细胞培养的目的。
但此法不如有限稀释法好。
（4）荧光激光细胞分类法：
用抗原包被的荧光乳胶微球标记杂交瘤细胞，然后根据抗原与杂交瘤细胞结合的特异性选出细胞，并进行单细胞培养。
6）细胞的冻存与复苏
7）大规模单克隆抗体的制备选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。
抗体制备有两种方法。
一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。
该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。
最普遍采用的是小鼠腹腔接种法。
选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。
通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。
该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。
此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
意义：
用于以下各种生命科学实验并具有医用价值
（1）沉淀反应：
Precipitationreaction
（2）凝集实验：
haemaglutination
（3）放射免疫学方法检测免疫复合物
（4）流式细胞仪：
用于细胞的分型和细胞分离。
（5）ELISA等免疫学检测
（6）BIAcorebiosensor:
检测Ab-Ag或与蛋白的
亲和力。
（7）免疫印记（westernblotting）
（8）免疫沉淀：
（9）亲和层析：
分离蛋白质
（10）磁珠分离细胞
（11）临床疾病的诊断和治疗；
23.植物细胞培养的培养基由哪些主要成分组成
（1）无机盐
（2）碳源
（3）植物生长调节剂
（4）有机氮源
（5）维生素
24.植物细胞大规模培养的主要方法及其特点是什么
（1）成批培养法：
将培养基一次性地加入反应器中，接种，培养一定时间后收获细胞的操作方式。
特点：
操作强度低，设备简单，容易发生污染，通气受限制。
（2）半连续培养法：
在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。
（3）连续培养法：
是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度采集细胞和培养液，并以同样速度供给诶新鲜培养基以使细胞生长环境长期恒定的方法。
（4）固定化培养法：
将细胞固定于尼龙网套内，或固定于中空纤维有网状多孔板，尼龙套和中空纤维膜上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。
25.影响植物细胞积累次级代谢产物的因素有哪些
（1）生物条件
（2）物理条件
（3）化学条件
（4）工业培养条件
26.各种植物细胞培养的生物反应器的特点是什么
（1）机械搅拌式生物反应器：
有较大的操作范围，混合程度高，适应性广，剪切力大，容易损伤细胞。
（2）鼓泡式生物反应器：
优于机械搅拌式反应器。
但由于鼓泡式反应器对氧的利用率较低，如果用较大通气量，则产生的剪切力会损伤细胞。
（3）气升式生物反应器：
广泛应用于植物细胞培养的研究和生产，最高细胞浓度和最短倍增时间可从气升罐中得到。
（4）转鼓式生物反应器：
生长速率高，其氧的传递及剪切力对细胞的伤害水平方面均优于气升式反应器。
（5）固定化细胞反应器：
可保护细胞免受剪切，可长时间重复使用，易于实现细胞的高密度培养，细胞接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成，减少细胞的遗传不稳定性，易于实现连续化操作。
27.植物细胞培养有哪些新进展
（1）诱导了在植物细胞工程研究中的应用
（2）前体饲喂
（3）两相法培养
（4）转基因技术在次级代谢产物生产中的应用
（5）植物身为转化技术与生物制药
28.酶工程主要研究内容是什么
（1）酶的分离、纯化、大批量生产及应用。
（2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。
（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶研究。
（4）酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。
（5）有机相中酶反应的研究。
（6）酶的抑制剂，激活剂的开发及应用与研究。
（7）抗体酶，核酸酶的研究。
（8）模拟酶，合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。
29.固定化酶回合固定化细胞的特点和优点各是什么怎样制备
固定化酶的特点和优点:
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；
（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；
（3）稳定性显着提高；
（4）可长期使用，并可预测衰变的速度；
（5）提供了研究酶动力学的良好模型。
固定化细胞的特点和优点：
1.使用固定化细胞省去了酶的分离过程，显着降低了成本。
2.固定化细胞为多酶系统，不需要辅助因子
3.增加了细胞对不利环境的耐逆性，可重复使用。
4.增加了酶的稳定性。
固定化酶制备：
（1）吸附法：
过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。
酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。
（2）包埋发：
将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。
前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；
后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。
（3）共价键结合法：
将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。
（4）交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。
由于酶蛋白的功能团，如氨基、酚基、巯基和咪唑基，参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶失活明显。
但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高。
固定化细胞的制备：
一种固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：
a．选用甲烷利用细菌Methylomonassp．GYJ3，在可供给微生物能量的甲烷和空气的混合气体中，辅以无机培养基进行培养；
b．培养好的菌体细胞离心后用无机培养基悬浮，加入到硅酸钠溶液和盐酸溶液制成的溶胶中，待溶胶凝固变成凝胶后，就制得了包埋的细胞，将包埋细胞置于低温环境中以增加包埋强度；
c．用磷酸盐缓冲液洗去包埋细胞的杂质，充入可给微生物提供能量的相应的甲烷与空气的混合气体，在摇床上培养48－120小时。
30.为什么要对酶进行化学修饰
（1）.更好的热稳定性以及抗核酸酶性对于临床应用很重要；
（2）提高酶蛋白在体内的半衰期；
（3）提高酶蛋白的靶向性；
（4）提高酶蛋白效力。
31.何谓分子印迹分子印迹的应用范围有哪些
分子印迹：
是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程。
应用范围：
（1）用于化学仿生传感器
（2）色谱分离
（3）固相萃取
（4）天然杭体模拟
（5）模拟酶催化
（6）控缓释药物
32.有机相酶反应的定义及其优点是什么
有机相酶反应：
是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行对的催化反应。
优点是：
（1）增加疏水性底物或产物的溶解度。
（2）热力学平衡向合成方向移动。
（3）可抑制有水剂中分离纯化产物。
（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。
（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。
（6）酶的热稳定性提高，PH的适应性扩大。
（7）无微生物污染。
（8）能测定某介质中反应时，通过改变溶剂，能够控制底物的特异性、区域选择性和立体选择性，并可以催化某些在水中不能进行的反应。
33.何谓人工模拟酶
人工模拟酶：
是指根据酶的作用机理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂。
34.发酵工程的研究内容包括哪些
发酵工程研究内容涉及：
菌种的培养和选育、菌的代谢与调节、培养基灭菌、通气搅拌、溶氧、发酵条件的优化、发酵过程各种参数与动力学、发酵反应器的设计和自动控制、产品的分离纯化和精制等。
35.微生物菌种诱变使用的主要诱变剂有哪些它们的诱变机制是什么
（1）物理诱变剂：
主要有紫外线、X射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等。
（2）化学诱变剂：
金属离子、一般化学试剂、生物碱、抗代谢物、生长刺激素、抗生素及高分子化合物、杀菌剂、染料等。
诱变机制：
1、碱基的类似物诱发突变
2、改变DNA的化学结构
3、结合到DNA分子上诱发移码突变
4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化
36.微生物发酵主要有哪些方式各具有什么特点
（一）分批发酵：
是将全部物料一次投入到反应器中，经灭菌，接种，经过若干时间的发酵后再将发酵液一次放出的操作方式。
（1）对温度的要求低，工艺操作简单；
（2）比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；
（3）对营养物的利用效率较高，产物浓度也比要高
（4）人力、物力、动力消耗较大；
（5）生产周期较长
（6）生产效率低
（二）补料分批发酵：
指在分批过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。
（1）可以解除底物的抑制、产物的反馈抑制和分解代谢物阻遏作用。
（2）可以减少菌体生长量，提高有用产物的转化率；
（3）菌种的变异及杂菌污染问题易控制；
（4）便于自动化控制
（三）连续发酵：
是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。
（1）设备的体积可以减小；
v
（2）操作时间短，总的操作管理方便，便于自动化控制；
（3）产物稳定，人力物力节省，生产费用低
（4）对设备的合理性和加料设备的精确性要求甚高；
（5）营养成分的利用较分批发酵差，产物浓度比分批发酵低
（6）杂菌污染的机会较多，菌种易因变异而发生退化。
37.影响发酵的主要因素有哪些如何对发酵过程进行控制
（1）温度温度对微生物的影响是多方面的。
首先，温度影响酶的活性。
在最适温度范围内，随着温度的升高，菌体生长和代谢加快，发酵反应的速率加快。
当超过最适温度范围以后，随着温度的升高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期缩短，产量降低。
温度也能影响生物合成的途径。
例如，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强，但当温度超过35℃时，则只合成四环素而不合成金霉素。
此外，温度还会影响发酵液的物理性质，以及菌种对营养物质的分解吸收等。
因此，要保证正常的发酵过程，就需维持最适温度。
但菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同。
如灰色链霉菌的最适生长温度是37℃，但产生抗生素的最适温度是28℃。
通常，必须通过实验来确定不同菌种各发酵阶段的最适温度，采取分段控制。
（2）pHpH能够影响酶的活性，以及细胞膜的带电荷状况。
细胞膜的带电荷状况如果发生变化，膜的透性也会改变，从而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分泌。
此外，pH还会影响培养基中营养物质的分解等。
因此，应控制发酵液的pH。
但不同菌种生长阶段和合成产物阶段的最适pH往往不同，需要分别加以控制。
在发酵过程中，随着菌体对营养物质的利用和代谢产物的积累，发酵液的pH必然发生变化。
如当尿素被分解时，发酵液中的NH+4浓度就会上升，pH也随之上升。
在工业生产上，常采用在发酵液中添加维持pH的缓冲系统，或通过中间补加氨水、尿素、碳酸铵或碳酸钙来控制pH。
目前，国内已研制出检测发酵过程的pH电极，用于连续测定和记录pH变化，并由pH控制器调节酸、碱的加入量。
（3）溶解氧氧的供应对需氧发酵来说，是一个关键因素。
从葡萄糖氧化的需氧量来看，1mol的葡萄糖彻底氧化分解，需6mol的氧；
当糖用于合成代谢产物时，1mol葡萄糖约需mol的氧。
因此，好氧型微生物对氧的需要量是很大的，但在发酵过程中菌种只能利用发酵液中的溶解氧，然而氧很难溶于水。
在kPa、25℃时，氧在水中的溶解度为mmol/L。
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