膜片钳技术的发展和应用Word文档格式.docx

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与电压钳一样，膜片钳也是利用负反馈电子线路，将微电板尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定水平，观察流过通道的离子电流。

其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域（膜片）形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接，从而可反映细胞上单一（或多数）离子通道的分子活动[2]。

1976年，德国科学家Neher和Sakmann首先用此技术对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行了研究，记录出了量值在皮安级（10-12A）的微弱电流[3,4]。

1981年，经Hamill等[5]后人的进一步完善，其电流测量灵敏度已达1pA，时间和空间分辨率达10us和1um。

随着膜片钳技术的出现，目前有几种不同的记录方式：

（1）细胞吸附式（cell-attachedpatch）将两次拉制后，经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面,形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。

（2）内面向外模式（inside-outpatch）高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。

（3）外面向外模式（outside-outpatch）高阻封接形成后，继续以负压抽吸，膜片破裂，再将玻管慢慢从细胞表面提起，断端游离部分自行融合形成脂质双层而得到。

（4）全细胞模式（whole-cellmode）在细胞吸附式的基础上，继续以负压抽吸，使电极管内细胞膜破裂，电极内液与胞内液直接相通而得到。

此方式既可记录膜电位又可记录膜电流。

（5）穿孔膜片钳记录（perforatedpatchmode），为克服常规全细胞模式的胞质渗漏问题，有学者将与离子亲和的制霉菌素或二性霉素B经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。

由于此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较常规全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。

2.2膜片钳的技术特点

膜片钳技术是用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜。

以吉欧姆（GΩ）以上的阻抗使之封接．使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。

膜片钳记录技术的优点有：

1最主要的是在GΩ封接形成的结果使漏出的电流极少，所以能正确地进行电压固定；

2GΩ封接使背底噪声水平达到极低。

因为由热噪声（Johnson噪声）引起漂动的标准误差与阻抗的平方根值成正比，所以，巨阻抗封接时可达到最小；

3膜片钳法对一般较小细胞也能在电位固定的条件下记录出膜电流；

4膜片钳技术可以直接控制细胞内环境。

2.3应用领域和最新进展

膜片钳技术广泛用于细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学[6]、病理生理学、神经科学[7]、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域的研究。

在体膜片钳技术

在体膜片钳是指在麻醉动物上直接对其脊髓或大脑神经元进行膜片钳记录的技术。

与分散神经元或组织片膜片钳技术比，最突出的优点是能够在整体条件下研究中枢神经元离子通道和突触活动的生理特点，还可通过口服及注射等整体给药途径观察药物作用，为从宏观角度研究和探讨作用于中枢神经系统药物的作用机制提供了新的途径。

在体膜片钳面临的难点在于：

1）前期准备步骤复杂。

动物麻醉后，还要继续静脉滴注麻醉剂以维持深度麻醉状态，同时适量补偿葡萄糖；

另外还需要做胸廓切开术，使用人工呼吸机，同时检测CO2潮气量、血压、心跳等。

2）形成高阻封接困难。

目前在体全细胞记录仍采用“盲插”，即在看不到细胞的情况下进行电极穿插。

由于在体神经元的体积较小，这样电极是否遇到细胞就很难判断。

另外，在体情况时，软脑膜几乎不可能剥离，并且神经元周围有大量的胶质细胞和纤维包围，这样电极在穿插过程中很容易堵塞。

目前只有通过施加正压保持电极清洁。

有实验室尝试使用辅助电极清理神经元表面。

辅助电极的尖端略大于膜片电极，施加较大正压，吹散周围组织，暴露神经元。

但这样增大了操作难度，并很可能损伤脑或脊髓组织，违背应用在体膜片钳技术的初衷。

德国马普研究所在最新研究报告中提出了靶向定位的方案，通过结合双光子显微镜、基因操作表达荧光标志技术，建立了双光子靶向膜片钳技术（two-photontargetedpatching，TPTP），进行在体全细胞记录研究[8]。

首先通过基因操作在动物脑内目标神经元中构建特异表达的荧光标记。

同时，在电极内液中也加入荧光剂，然后利用浸水荧光显微镜锁定神经元特异表达的荧光标志和玻璃电极内的荧光，以此为标记，在可视条件下，进行玻璃电极和神经元的封接和全细胞记录。

这样基本可以做到对特定神经元亚群的靶向研究。

如图1。

总之，整体动物实验反映的生理活动是体内各种生命过程的综合表现。

不仅视觉听觉触觉等必须应用整体动物模型，其他基本的神经生理活动的本质也将随着高新技术的出现，以无损伤非侵入式的方式，在整体动物模型上得到证明。

因此，应用在体膜片钳技术将会成为必然的选择。

阵列膜片钳技术

膜片钳阵列最初的设想足在一个384孔微板的每一个孔底部安装电极，每一个电极都连接一个放大器，并能进行全细胞记录，从而完成离子通道活性的大规模平行筛选[9]。

随着研究的不断深入，膜片钳阵列技术主要向2个方向发展，即基于微管的膜片钳电极阵列技术及平面膜片钳电极阵列技术。

由于平面膜片钳电极阵列技术是在平面材料上刻蚀孔来代替电极进行细胞的吸附，相对于微管电极阵列技术，可以达到更大的通量，成为科研人员目前研究的主要技术。

平面膜片钳阵列方法避免了电极微操作过程、显微镜的使用以及电极震动分离的可能性。

而且由于它的电容、通路电阻和绝缘体噪音更低，可以达到更高的记录水平。

由于电极的表面平坦，阵列装置完全适合于探针扫描技术的应用。

当扫描和电记录能同时进行时，一种新的阐明离子通道结构与功能关系的实验方法将变得可行。

另外，透明的平面电极也适合于光学测量。

但是，平面电极阵列技术仍然面临一些挑战，如寻找制作平面电极的合适材料（如硅、玻璃、塑料等）以及能够提高精密度和一致性的构建技术等。

相信新的电极技术将极大地简化传统的膜片钳记录技术[10]。

全自动膜片钳技术

随着科学的进步，时代的发展，使用传统微管电极进行膜片钳记录的自动化已基本实现。

有许多文献报道了膜片钳技术自动化方面取得的成绩。

Sophion公司已经研制了一个机器人膜片钳系统，在这个系统中，机器可以在显微镜下自动定位细胞、定位管和建立记录。

在CeNeS公司研究的装置中，细胞悬浮在一滴溶液中，一根玻璃电极从下面接近液滴，并与集中在气水界面的细胞接触，吸附以后自动进行电记录的操作。

自动化降低了仪器对操作者的依赖性，但显然仍不适于高通量应用。

近年来，在自动化技术基础之上，微管电极阵列开始逐渐发展。

Straub等在硅片芯片上设计晶体管微阵列与细胞形成高阻封接进行电记录，与传统膜片钳记录方法比较，使用这种方法形成封接之后通道的功能是完全的。

Csicsvari等使用硅电极微阵进行了神经细胞活性的平行记。

Nanion公司的PatchLinerNPC-16，MolecularDevices公司的IonworksHT和PatchXpress7000A全部采用的是平板微阵列技术。

其技术特点如下：

在平板电极上打磨或者使用金属离子轰击成孔，每孔都是大小均一的直径约1～21xm的小孔，每个小孔下面有电极连接到放大器，可对实验过程中的电流变化进行记录。

将细胞悬浮液加载到平板玻璃孔上，通过调节压力和吸力，一个细胞便可以自动定位在小孔上（相当于微管电极的尖端），自动进行封接，自动判断封接并进一步施加负压破膜以进行全细胞模式实验。

Flyion公司采用的是翻转膜片钳技术（FLIP-THE-TIP），全部操作过程由软件设定机器人完成。

流程如下：

机器人自动将细胞注入Fliptip微管（Flyion公司专利技术），然后自动把细胞冲洗到管尖底部，在负压的吸引下形成传统的吉欧封接。

自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。

随后，药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。

这种方式形成的膜片钳完全排除显微镜和显微操作，从而革命性的实现膜片钳技术的全自动化。

3．在生物医学工程中的应用

生物医学工程（BiomedicalEngineering,BME）是综合生物学、医学和工程学的理论和方法而发展起来的新兴边缘学科，其主要研究方向是运用工程技术手段，研究和解决生物学和医学中的有关问题。

多学科的交叉，使不同于那些经典的学科，也有于生物医学和纯粹的工程学科。

现在的生物医学工程在疾病的预防、诊断、治疗、康复等方起着巨大作用，世界各个主要国家均将它列入高技术领域，重点投资优先发展。

心脏是动物包括人类的最重要的器官之一，心脏疾病是已成为人类最大威胁。

大多数的心脏疾病都是致命性的，例如房室颤、心衰、心肌梗塞等等，而直接对人体进行大量的实验和病理情况的仿真并不现实，因此，利用生物医学工程学的方法建立虚拟心脏模型，并基于该类模型进行生理病理情况下心脏电生理的仿真研究，具有十分重要的意义。

虚拟心脏的建模，其基础是对心肌细胞的建模。

而心肌细胞的活动表现为两个方面：

力学变化和电学变化。

前者与心脏的泵血功能相关，而后者与心脏的节律活动有关，即兴奋在心脏内的发生与传播。

心肌细胞的电生理学就是研究心肌细胞在正常与异常情况下的兴奋发生与传播的机制。

当细胞发生兴奋而发生电学变化，即产生动作电位时，细胞内的钙离子浓度发生变化，继而引起细胞的收缩和舒张，产生力学变化。

因此，可以说电学变化是研究心脏的目标和基础。

研究心脏电生理的基础是单细胞电生理。

细胞膜上包含各种离子通道，有钠离子通道、钾离子通道、钙离子通道等等，而这些通道在细胞兴奋过程中的开放和关闭的变化，造成了整个细胞动作电位的形成。

因此，要建立单细胞的电生理模型，必须知道兴奋过程中，每个离子通道的变化情况。

这正是膜片钳能帮我们实现的。

离子通道可以分为背景通道和门控通道。

前者是指不论电压多少，它总是开放的，不需要给予任何刺激；

后者在一般情况下关闭，需要一定的刺激才能被激活。

门控型离子通道又可分为有失活门及无失活门的通道两种。

前者在激活后在一定的条件下失活门会关闭，使离子又不能通透。

后者没有失活门，因而也就没有失活过程。

一个含有失活门的门控型离子通道是比较典型的离子通道，它包括许多特定参数，例如：

峰值电流-电位曲线、稳态激活曲线、稳态失活曲线等等。

下面简述一下这些参数的测量过程。

峰值电流-电位曲线，是激活门开放的不同程度上所得到的离子流的最大值。

其测量过程如下：

将维持电位设置在静息电位附近，然后改变电位（Ec）到一个小一点的去极化电位值，将测得一个离子流。

重复这个步骤，将Ec的值设为更小的去极化电位值，例如每次增加10mV，这样可以测得一系列的离子流。

将各个离子流的最大值，关于相应电位（Ec）作曲线就是该离子流的峰值-电位曲线。

稳态激活曲线。

将细胞从一开始的维持电位（holding）突然变到控制电位（Ec）并保持一定时间，可记录到一个电流，在该电流的最大值时激活门达到该电位水平的最大开放状态，即稳态值。

在此时，突然将电位由Ec变到Et，则因为激活门来不及改变状态，使得有一个（Et-Ee）（Ee为该离子流的平衡电位）为驱动电位的离子流通过该通道（It）。

这个电流可以反应在电位Ec时激活门开放的程度。

重复这个步骤，但每次都改变Ec的电位值，即可得到一系列电流（It）的值。

把It关于Ec作图就是该离子的稳态激活曲线。

稳态失活曲线。

在静息状态下，失活门是开放的。

为了测得失活曲线，就要造成在不同电位下失活门部分关闭的状态。

此时突然开放激活门到完全开放的状态，由于失活门已处于部分关闭状态，其离子流必然比静息状态要小。

这样，继续预先改变电位，直到失活门完全关闭，此时就没有离子流出现。

具体如下：

将膜电位固定在Ec，经过一定时间后突然改变到充分去激活水平Et，此时就可以得到一个电流。

以后不断改变Ec的值，保持Et不变，得到不同的电流值。

以电位Ec为横坐标，电流为纵坐标，就可得到该离子流的稳态失活曲线。

测得了这些离子通道的特定参数，就可以利用数学方法构建该通道的数学表达式。

例如钠离子通道可以表示为：

INa=GNa*m3*h*j*（Vm–ENa）。

其中GNa是钠通道最大电导值，m是激活门，h和j是失活门，Vm是膜电位，ENa是钠离子平衡电位。

将这些通道整合到整个细胞模型中，就可以仿真出生理条件下细胞的电学变化过程，即动作电位形态。

基于此，根据膜片钳测得的数据，对模型中的参数进行调整，就能仿真不同生理条件下的电学变化过程，用以理解和分析病理情况下，细胞离子通道的变化情况。

进一步地，基于单细胞电生理模型，以及心脏的真实解剖结构，就能建立心脏的三维电生理模型，从而可以在宏观上进行正常和病理条件下的心脏电生理变化情况。

由此可见，膜片钳技术在生物医学工程，至少在虚拟心脏仿真建模上起到关键作用。

没有准确的、完整的临床实验数据，就没有能精确反应生理病理情况的心脏电生理模型。

而更为完善和高效的膜片钳技术必能推动心脏仿真建模工作的进一步发展。

4．展望

从1976年德国科学家Neher和Sakmann首先对蛙胸皮肌细胞膜上的己酰胆碱受体通道进行研究，膜片钳技术已经走过了30多年的不断发展和更新的过程。

在细胞膜离子通道电流的测量和细胞分泌、药理学、病理生理学、神经科学、脑科学、植物细胞的生殖生理等领域都得到了最广泛的应用，也点燃了细胞和分子水平的生理学研究的生命之火，并取得了丰硕的成果。

随着科技的进步和研究学者的不断努力创新，出现了更多更新的膜片钳技术。

例如阵列膜片钳、在体膜片钳、全自动膜片钳等一系列新技术，并一定会在更多更广的领域内得到广泛的应用。

比如生物医学工程领域。

利用膜片钳技术，可以定量的记录细胞电生理参数，甚至亚细胞电生理，有助于我们深入理解心肌细胞电生理的机制，并利用工程方法对心脏进行虚拟建模，从而方便快捷有效的仿真病理情况下心脏的电力学机制。

这必将在未来的临床诊断和治疗中起到十分关键的作用。

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