己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备Word下载.docx
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国内外大量研究表明[3],己烯雌酚可以破坏机体遗传物质,导致基因突变而引发机体肿瘤。
因此,国内外所颁布的食品安全法均规定,动物性产品及食品中不得检出己烯雌酚。
目前,国外已经建立了成熟的己烯雌酚残留免疫检测方法,并有相关的诊断试剂盒。
目前,国内检测己烯雌酚主要采用高效液相色谱（HPLC法或气相色谱2质谱（GC2MS法。
为开发研制具有我国自主知识产权的药物残留（包括己烯雌酚免疫检测试剂盒,达到能够对批量样品进行快速、准确检测的目的,特进行了本研究。
1 材料与方法
111 主要试剂和仪器 己烯雌酚,纯度99%,美国Sigma公
司产品;
琥珀酸酐,上海化学试剂公司;
氯甲酸异丁酯,CP,上
海飞详化工厂;
三正丁胺,CP,北京化工厂进口分装;
牛血清白蛋白（BSA,华美生物工程公司;
其他试剂均为AR级。
ZAB2HS仪器、FT2MSAPXX仪器、
凝胶成像系统（UVPBioimagingSystem及其分析软件（labworks410ImageAc2
quisitionandAnalysisSoftware。
112 试验动物 成年健康家兔,体质量215kg左右,购自青
岛医学院试验动物中心。
113 己烯雌酚半琥珀酸酯（DES-HS的合成 DES2HS的合成路线如下:
HO
C
C2H6
CC2H6
OH+ OCO
CH2C
O
CH2HO
C2H6CC2H6
CO
CH2
OH 收稿日期:
2003212222
作者简介:
陈德坤（19642,男,副教授,博士。
将70mgDES溶于5mL吡啶中,搅拌至完全溶解,再加入琥珀酸酐25mg,置于通风橱中,在室温下搅拌48h。
反应完成后,将反应液移入30mL冰蒸馏水与5mL浓盐酸组成的混合液中静置过夜,抽滤析出的沉淀,并以蒸馏水洗至
pH515左右,真空干燥,得粗产品。
将所得粗产品加入丙酮溶
解后,拌入等量的硅胶,室温下晾干,用200~300目硅胶柱层析分离,用TLC监测,收集Rf=0109（展开剂,石油醚∶丙酮
=3∶1的点合并,常温下干燥,即得DES2HS纯品。
对该物质进行高分辨质谱测定。
114 DES-HS-BSA的合成 将DES2HS2BSA50mg溶于二氧六环中,置4℃下10min,然后加入20ΛL三正丁胺,混匀,再加入15ΛL氯甲酸异丁酯,4℃条件下搅拌30min,此为甲液。
另取150mgBSA溶于20mL的70%二氧六环水溶液中,此为乙液。
将甲液与乙液合并,4℃下搅拌过夜,将反应液流水透析2h,然后换成平衡盐溶液继续透析48h。
浓缩透析液,冷冻干燥。
用5%的积层胶和10%的分离胶对DES2HS2BSA进行SDS2PAGE鉴定,通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得
出DES2HS2BSA的分子量,以此为依据推算单个BSA上结
合DES2HS的数目。
115 DES-HS-OVA（卵清蛋白的合成 参照方法114进行。
116 动物免疫试验 用无菌生理盐水溶解DES2HS2BSA后,与等量的弗氏完全佐剂混合,在混合振荡器上充分振荡,使其完全乳化,DES2HS2BSA的最终含量为1gL。
在家兔脊椎两侧交叉选取6~8个点,做皮下注射免疫,免疫剂量为2
mL
只。
20~25d,进行第2次免疫,免疫途径及免疫剂量同第1次,佐剂为弗氏不完全佐剂。
以后,每隔15d加强免疫1次,免疫剂量均为上次的2倍,免疫途径为皮下注射,免疫时不使用弗氏佐剂。
免疫共进行6次,最后1次免疫后10d,经心脏无菌采血,分离免疫血清。
117 抗DES抗体的测定 按照常规的琼脂双扩散试验进行。
在1%琼脂糖凝胶上打出梅花孔,挑去孔中琼脂块,用015%融化琼脂封底。
向中央孔加入分离的免疫兔血清,周围孔分别加DES2HS2BSA、OVA、DES2HS2OVA,在37℃感作24~48h后,将琼脂糖凝胶用生理盐水漂洗24h,用011%考马斯亮蓝染液染色,经脱色后,对琼扩试验结果照相。
2 结果
2.1 DES-HS的高分辨质谱测定结果 FABMS测定结果为,
M+368（63（M+Na+391（17,351（M2OH（16,307（M2OH2CO2（6（图1。
HRMS分析,C22H24O5+NH4计算值
为38611962,实测值为38611959,误差017ppm,在10ppm范围内。
结果表明,新合成的DES2HS的分子量为386
。
图1 DES2HS的质谱测定结果
2.2 DES-HS-BSA的SDS-PAGE结果 为进一步证实BSA
分子上确实挂载了DES半抗原,并计算出每个BSA分子上
所结合的半抗原数目,对DES2HS2BSA进行了SDS2PAGE（图2。
电泳图谱显示出BSA的泳动速度大于DES2HS2BSA,说明DES2HS2BSA的分子量大于BSA,证明DES2HS已经结合在BSA上。
通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得出,DES2HS2BSA的相对分子质量为77950,BSA的相对分子质量为66200,每个BSA分子上结合的半抗原数目为（77950-66200÷
368≈32
图2 DES2HS2BSA的SDS2PAGE结果 11Marker;
21BSA标准
品;
31DES2HS2BSA
2.3 抗DES-HS抗体的测定结果 以DES2HS2BSA免疫家
兔,家兔不仅产生针对DES2HS的抗体,还产生针对BSA表面功能抗原决定簇的抗体,这是琼扩试验中免疫血清孔和DES2HS2BSA孔之间形成的沉淀线比较粗的原因（图3。
由于BSA和OVA无共同的抗原性[4],因此OVA孔和中央孔之间无沉淀线形成。
DES2HS2OVA孔和中央孔之间形成1条细而清晰的沉淀线,并且该沉淀线与免疫血清孔和DES2HS2BSA孔之间形成的沉淀线完全融合,说明免疫血清中确实含有抗DES2HS的抗体
图3 抗DES抗体的琼扩试验结果 中央孔1免疫血清;
1,3孔.
DES2HS2BSA;
4,5孔.DES2HS2OVA;
2,6孔.OVA
3 讨论
小分子药物残留是影响动物性食品安全的关键因素之
一。
对这类小分子残留的常规检测方法主要有液相色谱法、气
相色谱法等。
这类方法灵敏度高、准确,但比较耗时,且需要的
仪器昂贵,难以进行大批量样品的检测。
为满足实践中批量样品残留检测的需要,近年来相继研制出了多种用于小分子药物残留检测的免疫试剂盒,如盐酸克伦特罗、氯霉素等免疫检测试剂盒。
国内尚未见己烯雌酚残留免疫检测试剂盒研制的报道。
本研究制备出的抗己烯雌酚抗体,为下一步研制己烯雌酚残留免疫检测试剂盒奠定了基础。
半抗原本身无免疫原性,只有当其与载体结合后,才能够获得免疫原性。
对于没有氨基或羧基基团的半抗原,必须进行适当的化学修饰,在其上加载1个含有氨基或羧基的基团,才可以将其连接到载体上。
己烯雌酚便属于此类半抗原。
对己烯雌酚进行化学修饰应当尽可能不影响己烯雌酚的结构和构型,否则免疫动物制备出的抗体可能与己烯雌酚本身的亲和力较差,或与其他物质发生交叉反应的几率较高。
考虑到己烯雌酚本身属于小分子,所以在加载功能性羧基基团时,我们使用的是丁二酸酐,只与己烯雌酚一侧的酚羟基反应,形成己烯雌酚半琥珀酸。
这样,不仅最大限度地减少了对己烯雌酚本身结构和构型的影响,而且形成的己烯雌酚半琥珀酸有一个较长的“臂”,与载体结合后有利于淋巴细胞的免疫识别。
据报道[5],当1个载体结合25~35个半抗原分子时,免疫动物相对容易产生抗体。
本试验以含有32个DES的BSA2HS2DES免疫家兔,用琼脂双扩散试验进行的特异性抗体检测也证实了这一点。
Rombauts等[6]报道,DES也能够与Χ
2乙基溴化丁酸盐反应,产物为DES2Χ2乙基溴化丁酸。
他们通过Χ2乙基溴化丁酸盐与己烯雌酚一侧的酚羟基发生化学反应,在己烯雌酚上加上一个“臂”长为4个碳原子的带有羧基的基团,从而使经过化学修饰的己烯雌酚能够与载体结合。
但是他们制备的经过化学修饰的己烯雌酚极不稳定,且难以提纯。
本试验制备的DES2HS稳定性较强,也能够提纯,这不仅有利于对DES2HS进行分析鉴定,同时对于下一步将DES2HS顺利地结合到BSA上十分重要。
本研究制备抗己烯雌酚抗体,不仅为建立己烯雌酚残留的免疫学检测方法打下了良好基础,也为进一步研制抗己烯
雌酚单抗提供了很好的手段。
（本研究在进行己烯雌酚化学修饰的工作中,得到兰州大学化学
系田暄教授的大力协助,并承蒙田暄教授对质谱结果进行分析判定,在此表示衷心感谢
参考文献:
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192121924.
SynthesisofDiethylstilbestrolandthePreparationofItsAntibody
CHENDe2kun1,ZHENGZeng2ren2,QUZhi2na2,LEILi2hui1,ZHANGPei2jun3
（1.Collegeof
AnimalHusbandryandVeterinaryScience,NorthwesternSci2TechUniversityofAgricultureand Forest,Yangling,Shaanxi712100,China;
2.QuarantineInstituteofAgriculturalMinistry,Qingdao 266032,China;
3.
BiologyDepartmentofShaanxiEducationalInstitute,Xi′an710003,China
Abstract:
Diethylstilbestrolhemisuccinate（DES2HSweresynthesizedandcoupledtobovineserumalbumin（BSAwith
mixed2anhydridemethod,andthepurifiedDES2HSwereidentifiedbyhighmassspectra（HRMS,andtheBSA2HS2DESwere
identifiedbySDS2PAGE.BSA2HS2DESwereinjectedtobigearrabbits6timesincertaininterval
.Antibodytodiethylstilbestrolweredeterminedbyagardiffusiontest.TheresultsshowedthatthemolecularweightofsynthesizedDES2HSin36811959,andthenumberofDES2HScoupledtoeachBSAmoleculeis32.Theantibodytodiethylstilbestroldoesexistintheimmunizedrab2bitserum.Itwasdemonstratedthatartificialimmunogenofdiethylstilbestrolcouldbesynthesizedbymixed2anhydridemethodandthespecificityofthepolyclonalanti2diethylstilbestrolantibodiescouldbeproduced.
Keywords:
diethylstilbestrol;
succinicanhydride;
bovineserumalbumin（BSA;
mixed2anhydridemethod;
anti2diethyl2
stilbestrolantibodies
半胱胺对成年鹅血浆中几种激素及胆固醇水平的影响
艾晓杰1,郑元林2,刘根桃2,陈伟华2,韩正康2 （11上海交通大学农业与生物学院动物科学系,上海201101;
21南京农业大学农业部动物生理生化重点实验室,江苏南京210095
以14只装有超静脉瘘管的成年杂交鹅（川白×
太湖,圈养,自身对照。
试验期于日粮中一次性添喂半胱胺（按每千克体质量100mg,经瘘管采取对照期和处理后第1、3、5、7天的血样,用RIA双抗法和分光光度法分别测定激素和胆固醇的含量。
试验期各天,生长抑素的含量较对照期的（1189±
0110ΛgL分别显著降低（P<
0101或P<
010541118%、26174%、37143%、17111%;
甲状腺素水平较对照期的（5141±
0198ΛgL分别显著升高60126%、43125%、37115%、16182%;
胰高血糖素的水平,在第1、3天显著高于对照期（0156±
0103ΛgL17186%、21143%,第5天又降到低于对照期26179%（P<
0105,第7天回升到接近对照期水平;
胆固醇在第1、2天分别显著低于对照期（5119±
0147mmolL25182%和19165%,而第7天却高于对照期10198%（P<
0105。
结果提示,半胱胺能够降低成年鹅血液中生长抑素含量,使甲状腺素和胰高血糖素水平升高,胆固醇水平降低,由此影响类脂的代谢,有利于促生长。
半胱胺;
激素;
胆固醇;
鹅
S81617;
S8521295;
S835 文献标识码:
100524545（20040420366203 半胱胺（cysteamine,CS能降低动物中枢神经系统及外周组织中生长抑素（somatostatin,SS的免疫活性[1],影响与生长相关激素的释放[2]及血液生化指标[3],且生理效应具有周日节律[4,5]。
本试验旨在通过研究添喂CS对成年鹅血浆中
收稿日期:
2003204201
基金项目:
国家自然科学基金资助项目（39570536 作者简介:
艾晓杰（19622,男,副教授,博士。
胆固醇及其相关激素水平的影响,以探讨CS对鹅神经内分泌和类脂代谢调节的动态机理。
111 试验动物及药品 14只成年鹅（川白×
太湖,体质量为（215±
0112kg,由南京农业大学江浦农场畜牧试验站提
供,圈饲,自由采食和饮水。
日粮配方:
大麦粉45%,玉米17%,豆饼15%,菜籽饼
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