植物细胞工程zhongkai.docx
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植物细胞工程zhongkai
绪论
植物组织培养（planttissueculture），是指在无菌条件下，将植物体的任何一部分，或器官、或组织、或细胞、或原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养环境条件进行离体培养，使之成为完整的植物体。
植物体的任何一部分是指根、茎、叶、花、果以及它们的组织切片和细胞。
外植体（explant）：
在组织培养中，把由活植物体（invivo）上切下来以进行培养的那部分组织或器官。
按外植体的来源分为：
（1）器官培养（organculture）：
是指用植物体的全部或部分器官原基接种于培养基上，这些培养的组织块可经过脱分化、产生愈伤组织，并进而再经过分化培养成幼苗。
（2）胚胎培养（embryoculture）：
指以胚珠、幼胚、成熟胚的离体培养，也包括胚乳培养或子房培养。
常用幼胚作材料。
（3）组织培养（tissueculture）：
分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等和各种器官组织，以及其培养产生的愈伤组织的培养。
（4）细胞培养（cellculture）：
通过愈伤组织的液体振荡培养法而获得游离细胞或细胞群的培养。
（5）原生质体培养（protoplastculture）：
将植物体细胞的细胞壁，通过酶解使各细胞的原生质体形成游离状态，再进行培养，包括原生质体培养、原生质体融合（细胞杂交）、原生质体的遗传操作。
第二章培养基
培养基，是外植体生长的营养物质，通常含有两个组成成分，即基本培养基和附加成分。
基本培养基是只含有无机营养成分和有机营养成分的培养基。
基本培养基的配方有几百种，常用的近10~20种。
完全培养基，是在基本培养基的基础上，根据要求添加一些PGR和复杂的有机物质。
（一）根据含无机营养成分的浓度高低，把培养基分为高盐型、中盐型和低盐型。
（二）根据培养基凝固情况分为固体培养基和液体培养基
1.固体培养基加入了适量的凝固剂的培养基，如琼脂、卡拉胶、明胶等。
2.液体培养基没有加入凝固剂的培养基，主要用于细胞的悬浮培养，抗褐化培养。
三、培养基的成分
培养基的成分主要可分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。
1、水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中不可缺少的物质。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发变质。
大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2、无机元素（inorganicelement）
2.1大量元素，指浓度大于0.5mmol/L的元素，有N,P,K,Ca,Mg,S等。
其作用是：
（1）N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，是培养物生长、胚胎发生所必需的物质。
在制备培养基时以NO3-N和NH4-N两种形式供应。
（3）K对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。
2）P是磷脂的主要成分。
而磷脂又是原生质、细胞核的重要组成部分。
磷也是ATP、ADP等的组成成分。
在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。
K增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。
（4）Mg、S和Ca、Mg是叶绿素的组成成分，又是辅酶的活化剂；S是含S氨基酸和蛋白质组成成分。
Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2.2H2O提供。
（5）微量元素指小于0.5mmol/L的元素，Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。
铁是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。
同时，它又是叶绿素形成的必要条件。
培养基中的铁对胚的形成，芽的分化和幼苗转绿有促进作用。
B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长发育异常现象。
高等植物一般不需要Na+，但对喜盐植物重要，C4植物也需要。
3.有机化合物（organiccompound）
（1）碳水化合物
糖类在培养基中除了作为碳源和能源外，还具有维持培养基一定的渗透压作用，蔗糖约有1/4-2/5用于保持培养基的渗透压。
（2）维生素（vitamin）这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。
虽然大多数的植物细胞在培养中都有合成所必需的维生素，但在数量上还明显不足，通常需加入1至数种维生素，以便获得最良好的生长，主要有VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VPP（烟酸）、VC（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。
一般用量为0.1~1.0mg/L。
有时用量较高。
VB1可能是必需的，对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，VPP与植物代谢和胚的发育有一定关系。
VC有防止组织变褐的作用。
（3）肌醇（myo-inositol）又叫环已六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。
通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构成建细胞壁。
（4）氨基酸（aminoacid）是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。
培养基中最常用的甘氨酸。
（5）天然复合物它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。
4.植物生长调节剂（plantgrowthregulator）
在培养基的各成分中，PGR或植物激素是培养基的关键物质，其用量虽少，但对外植体愈伤组织的诱导和器官的分化起着重要的和明显的调节性作用。
（1）生长素类（auxin）在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。
在促进生长方面，根对生长素最敏感。
在极低的浓度下，（10-5~10-8mg/L）就可促进生长，其次是茎和芽。
天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏，在植物体内也易受到体内酶的分解。
组织培养中常用人工合成的生长素类物质。
IAA（indoaceticacid）是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。
NAA（naphthaleneaceticacid）在组织培养中的启动能力要比IAA高出3~4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易分解破坏，所以应用较普遍。
NAA和IBA广泛应用于生根，并与细胞分裂素互促进芽的增殖和生长。
IBA（indolebutyricacid吲哚丁酸）是促进发根能力较强的生长调节物质，不易被过氧化物酶分解，但价格较贵。
2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）启动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。
适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。
作用强弱顺序：
2,4-D>NAA>IBA>IAA。
生长素配制时可先用少量95%酒精助溶。
2,4-D可用0.1mol/L的NaOH或KOH助溶。
生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。
（2）GA（gibberellicacid）赤霉素有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同，培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。
一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。
一般用量为0.1mg/L。
赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95%酒精助溶。
赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70%~100%失效，应当采用过滤灭菌法加入。
（3）细胞分裂素类（cytokinin）有两类，一类是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA（6-苄基氨基嘌呤）、Kt（kinetin激动素）、Zt（zeatin玉米素）、2-iP（2-异戊烯腺嘌呤）等。
另外一类是苯基脲类，主要有吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ）。
在培养基中添加细胞分裂素有3个作用：
1、促进细胞分裂和分化，增强蛋白质的合成，延缓组织的衰老。
2、诱导芽的分化，抑制顶端优势，促进侧芽萌发生长。
细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素/生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。
3、抑制根的分化。
因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。
作用的强弱顺序为：
TDZ,4PU>ZT>2-iP>BA>KT。
但在组织培养中常用的是人工合成的、性能稳定的BA和KT。
价格（美元/g）BA5.25，2-ip26，ZT735，TDZ2500。
生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是长愈伤组织、长根还是长芽。
如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。
PGR的使用甚微，一般用mg/L表示浓度。
在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05~5mg/L,细胞分裂素0.05~10mg/L。
5.培养材料的支持物
（1）琼脂（agar）在固体培养时琼脂是最好的固化剂。
琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。
6.抗生物质（antibiotic）
抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5~20mg/L之间。
添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。
尤其对大量通气长期培养，效果更好。
7、抗氧化物（antioxide）
植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，接触空气中的氧气后，自动氧化或由酶类催化氧化为相应的醌类，产生可见的茶色、褐色以致黑色，这就是酚污染。
这些物质渗出细胞外就造成自身中毒，使培养的材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。
8、活性炭（activecarbon）
活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。
茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于VC和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阀值，一般为0.1%~0.2%，不能超过0.2%。
活性炭在生根时有明显的促进作用，其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进了茎、叶的生长。
此外，在培养基中加入0.3%活性炭，还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。
活性炭在胚胎培养中也有一定作用，如在葡萄胚珠培养时向培养基加入0.1%的活性炭可减少组织变褐和培养基变色，产生较少的愈伤组织。
但是，活性炭对物质的吸附是无选择性的，既吸附有害物质，也吸收有利物质
第二节培养基的制备
一、母液（stocksolution）的配制和保存
在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。
为简便起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。
所谓母液是欲配制液的浓缩，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。
母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和PGR类等。
配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、配制倍数、日期及配1L培养基时应吸取的量。
二、培养基的配制
1.琼脂溶解用瓷量杯装蒸馏水或自来水300ml，加入琼脂条（或琼脂粉）5-7g，边加热边搅拌，防止糊底。
旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化即清澈见底为度。
2.称好20-30g蔗糖，趁热加入瓷量杯中溶解。
3.按表用量筒分别移取大量元素母液1、2、310ml，用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液15ml、20.5ml、铁盐母液5ml、有机物母液5ml，均置入1烧杯中，若不加任何激素，则为MSO培养基；若需加激素按配方移取激素母液即可。
将所有母液的混合液加入瓷量杯中，定容至1000ml。
4.pH调整培养基配好后，用0.1mol/L的NaOH或HCI液将培养基的pH值调整为6.0左右。
调后注意一定要摇动均匀，还要注意酸或碱液不要放置时间太久。
三、培养基的分装与灭菌
培养基合成后要趁热分装，100ml的容器约装入25~30ml培养基，即1L培养基约装33-40瓶左右。
太多则浪费培养基，太少不易接种和影响生长。
但要根据培养对象来决定。
如果培养时间较长时，应适当多装培养基，生根等短期培养时，可适当少加培养基。
分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。
装后用封口材料包扎瓶口，扎口后，写上培养基种类，准备灭菌，注意不能放置时间过长，以免产生污染。
培养基用高压灭菌。
灭菌好的培养基不要放置时间太长，1~2周用完，最多不能超过1个月。
第三章植物材料与处理
第一节植物材料的选择与处理
二、母树（株）和外植体的预处理
植物材料的预处理，近来被重视和研究的较多，国际上把这一阶段定名为StageO，目的有二，其一是为获得比较清洁的材料，其二是为了改变母株或外植体的生理状态，使接种后能更好地生长分化。
（一）栽培管理
1.不要连作以免土传病虫害的加剧，特别是对地下球茎、鳞茎或根茎等作材料的，危害更大。
此外，连作还会有矿质营养元素缺乏、作物根系分泌物的毒性危害等。
2.基质或无土栽培最好使用蛭石、珍珠岩、泥炭等基质进行栽培，如果是土壤作基质，在栽种前要用药物或蒸汽进行灭菌处理。
3.施肥和灌溉控制基肥应在取材前1~2个月进行，追肥应使用化肥，不要使用喷灌，避免将水、肥浇到植株上，以保证田间的清洁，减少病菌活动的机会。
4.病虫害防治以确保植株的健壮生长，特别是临近取材前，更应用杀菌剂、抗生素处理。
如在采集外植体前用敌菌丹（captatol）或异菌脲（iprodione）杀菌剂处理田间的披散山龙眼母树，使污染从对照的90%减少至14%。
Mondal等在采集材料前，向番木瓜植株喷1000mg/L的庆大霉素（gentamycin），采芽后再用庆大霉素进行处理。
5.适宜的环境要求场地开阔、阳光充足、通风透气。
最好在能控制光照、温度、湿度的温室或人工气候室内栽培，创造生长发育的最适条件，促使植物的生长代谢活跃，外植体的生理状态得到改善。
（二）田间母株的处理
1.光照
1.1光周期对光周期敏感的植物，在控制光周期条件下培养，可以得到对培养条件反映更稳定的外植体。
如高温和长日照处理秋海棠植株叶片有利离体条件下的分化。
1.2光质光质对矮牵牛的生长有影响，最后一次是红光，植株分枝多，远红光则不分枝，前者的叶片在培养时芽的分化比后者要多3倍。
1.3黑暗或黄化（etiolation）长时间的黄化处理，有利于板栗、苹果成年树的茎尖培养或侧芽的分化，黑暗被广泛用于木本植物母树的预处理，以减少褐化和内源菌的污染。
2.温度
2.1低温促进花药培养如大白菜花药培养中在3-5℃下48-72hr，可以促进胚状体形成；打破休眠如某些鳞茎、木本植物的种胚和芽存在休眠期，需要低温处理。
如花棱草种子需要低温休眠，胚培养时需给予2周6℃的处理。
防止酚污染，如核桃茎段机关5℃12-24hr处理可减少褐变。
2.2高温脱去植株的部分病毒。
3.PGR的预处理
对母树的处理一般用喷洒，有时也用注射的方法。
木本植物用100-1000mg/L6-BA处理可提高茎尖培养的成功率。
用CCC处理番茄可使外植体芽的分化大量增加。
将矮牵牛叶片在400mg/LKT中浸5s-10min，可较大地促进芽分化。
（三）从田间或野外采集后的材料处理
1.在温室或人工条件下培养一段时间，或在树上套袋，使用新生的部分。
2.木本植物枝条取回后用水冲洗干净后插入无糖的培养液或自来水中，使其发枝，然后以这种新抽的嫩枝作为外植体。
一些木本植物的茎尖外植体用催芽溶液（forcingsolution）（基本成分为八羟基喹啉8-hydroxyquinolecitrate200mg/L，6-BA100-800mg/L和GA10-100mg/L，蔗糖2%）处理，常可提高培养的成功率。
一般做法是将木本植物的外植体有forcingsolution处理一段时间（24hr）再接种到培养基上。
3.黄化处理在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时取材，如使用仙客来黄化的叶柄进行培养时，可控制内生菌的污染。
4.热击Langens等将美丽百合（Liliumspeciosum）的鳞茎外植体放入试管中进行43℃热击处理，罗伯利槭的休眠芽进行42.5℃或45℃热击处理，可有效地减少内生菌污染。
5.用抗生素进行预培养朱光廉对相思树的芽和茎段灭菌时，用皂液刷洗和乙醇杀菌后，转入0.2%苯菌灵（benlnete）和0.2%链霉素溶液中，在摇床上振荡过夜。
湿热灭菌即高压蒸汽灭菌，是最有效的一种方法。
布类（如工作服、口罩）、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液都可用此法灭菌。
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
第二节外植体灭菌
1.茎尖、茎段、叶片灭菌的方法
（1）植物的茎、叶部分多暴露在空气中，易受到泥土、肥料中的杂菌污染。
将采来的材料除去不用的部分，表面不光滑或长有绒毛难以洗净的材料，要用毛刷充分刷洗。
把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几min至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。
易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。
流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。
洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。
当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
洗后的材料用滤纸吸干水分。
（2）对材料的表面浸润灭菌。
要在超净台或接种箱内完成，准备好灭菌的烧杯、玻璃棒、75%酒精、灭菌液、无菌水等。
用75%酒精浸泡10~30s，一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用75%酒精处理稍长的时间。
处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
（3）用灭菌剂处理。
表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1~2种使用见表4-5。
上述灭菌灭剂应在使用前临时配制，氯化汞可短期内贮用。
灭菌时，把植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入灭菌溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与灭菌溶液充分接触，驱除气泡，使灭菌彻底。
在快到时间之前1~2min，开始把灭菌液倾入一备好的大烧杯内，要注意勿使材料倒出，倾净后立即倒入无菌水，轻搅刷洗。
灭菌时间是从倒入灭菌液开始，至倒入无菌水时为止。
记录时间还便于比较灭菌效果，以便改正。
灭菌液要充分浸没材料，宁可多用些灭菌液，切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温-80或TritonX效果较好，这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。
但吐温加入后对材料的伤害也在增加，应注意吐温的用量和灭菌时间，一般加入灭菌液的0.1-0.5%。
最后一步是用无菌水刷洗，刷洗要每次3min左右，视采用的灭菌液种类，刷洗3~10次左右。
无菌水刷洗作用是免除灭菌剂杀伤植物细胞的副作用。
2.其他外植体灭菌的方法
（1）果实和种子的消毒视果实和种子的清洁程度，先用自来水冲洗10~20min，甚至更长时间。
再用75%酒精迅速漂洗一次。
果实用2%NaClO溶液浸10min，后用无菌蒸馏水冲洗2~3次后，就可取出果实内的种子或组织进行培养。
种子则先要用10%NaClO溶液浸泡20~30min，对难以消毒的还可以用0.1%汞或1%~2%溴水消毒5min。
（2）根及地下部器官的消毒由于它们长在土壤中，可预先用自来水冲洗、软毛刷刷洗，再用纯酒精漂洗后，置于0.1%~0.2%升汞浸5~10min或2%NaClO溶液浸泡10~15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水分后即可接种。
若条件许可，还可将材料浸入消毒液中进行抽气减压，以帮助消毒液渗入，达到彻底灭菌的目的。
（3）花药的消毒通常用于组织培养的花药，实际上多未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，基本上处于无菌状态，故只需将整个花蕾或穗消毒即可以了。
一般用75%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2~3次，再在漂白粉上清液中浸泡10min，经无菌水冲洗2~3次即可接种。
3.难灭菌材料的特殊方法
（1）间隙灭菌法按常规灭菌后，将外植体培养在一不含PGR和维生素的简单培养基上20-24hr，取出，再消毒一次，接入正式培养基中。
（2）预培养法将植物材料放入混和抗生素和杀菌剂的溶液中振动培养4-12小时，然后再按常规灭菌程序消毒。
（3）减压抽滤法将植物材料放入杀菌剂中，减压抽去植物组织中的气体，使杀菌剂更容易进入组织，维持数min后，取出再按常规方法消毒。
（4）培养基中加入抗生素、杀菌剂法在培养基中加入少量的抗生素10-20mg/L，能有效地抑制细菌的生长；加入一些杀菌剂如甲基托布津、多菌灵等，也有一定的杀菌作用。
外植体大小
目前许多植物的茎尖培养表明，外植体（茎尖）越小成活率越低。
因此除非用于去除病毒，否则不宜将外植体切得太小。
在甘蔗心叶愈伤组织的培养中发现，材料大小对分化生长有明显的影响（表3—1）。
通常情况下，叶片、花瓣等面积约为5mm2，茎段则长约0.5-1.0cm。
但并不是说外植体越大越好，外植体过大，不易彻底灭菌。
如木薯，只有在2mm以上长的茎尖才能形成完整植株；长度不到2mm的茎尖仅产生愈伤组织或根。
但脱毒培养多用较小的外植体，如麝香石竹用2mm大小的外植体时只长根，而用7.5mm大小的外植体培养则仍有病毒存在。
此外，外植体的大小与褐变及玻璃化有关。
如金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重；当茎尖长度在5~15mm时褐变较轻，成活率可达85%（蒋迪军、牛建军，1992）。
第三节无菌操作技术
一、接种前的准备
接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起。
为了做好接种前的准备工作，宜制定出分门别类的操作卡片，包括操作程序（Protacol/Procedure）卡片，如过滤灭菌液加入培养基的分装、外植体接种、继代培养等等。
各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等，这对初学者尤为重要。
1.接种室内消毒保持定期用1%~3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗，并用甲醛熏蒸接种室。
2.洗手和着装接种员的头发、衣服、手指都不同程度地带有许多杂菌，先剪除指甲，用肥皂洗净双手，最好再用0.2%新洁尔灭溶液擦洗或浸泡10min；在缓冲间换好专用实验服，戴上帽子，并换穿拖鞋等；
3.培养皿、酒精灯和其他工具应事先放在超净工作台上，并用75%酒精擦洗或喷洒消毒。
工作台面上的用品要合理布局，原则上应是右手使用的东西放在右侧，左手用品放在左侧，酒精灯置于中央。
如图。
4.在接种前打开超净工作台的风机，接种前用紫外灯照射20-30min，接种室空间大的需用30-50min。
超净工作台也有紫外灯，主要用于消毒台面上用品，对台面流动的空气无意义。
紫外灯照射后15min，操作人员方可入内。
5.在使用期间用75%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使使空气中的细菌和真菌孢子随灰尘的沉降而沉降。
6.上工作台后，经常用75%酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。
7.超净工作台面要用0.2%新洁尔灭或75%酒精擦洗，使超净工作台
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