1046 大肠杆菌检查法标准操作程序.docx

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1046大肠杆菌检查法标准操作程序

1目的：

规范大肠杆菌检查操作，保证检验结果准确。

2范围：

本程序适用于药品大肠杆菌的检查。

3责任者：

QC员、QC复核人员、QC主任。

4程序：

4.1试药与试液

除特别注明外，试验中所用的试剂均为分析纯试剂，水为纯化水。

4.1.10.9%无菌氯化钠溶液

取氯化钠[NaCl]9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。

4.1.2无菌磷酸盐缓冲溶液（pH7.2）

取磷酸氢二钠[Na2HPO4·12H2O]25.8g和磷酸二氢钠[NaH2PO4·H2O]4.4g，加水使溶解至1000ml，121℃灭菌20分钟。

4.1.3α－萘酚乙醇试液

取α－萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。

4.1.440％氢氧化钾试液

取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。

4.1.5靛基质试液

取对二甲氨基苯甲醛[C9H11NO]1g，加入95%乙醇[C2H5OH]95ml，充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸[HCl]20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。

4.1.6甲基红试液

取甲基红[C15H15N3O2]0.1g，加95%乙醇[C2H5OH]300ml与水适量，使溶解，再加水至500ml，即得。

4.1.7V-P试液

取α-萘酚[C10H7OH]6.0g，加无水乙醇[C2H5OH]使溶解成100ml。

另取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml。

分别将试药与各溶剂混合即得。

4.1.8革兰染色液

4.1.8.1沙黄染液

取沙黄0.25g，加95%的乙醇[C2H5OH]10ml，使完全溶解后，加水至100ml。

4.1.8.2结晶紫染液

取结晶紫[C25H30ClN3]1.0g，加95%的乙醇[C2H5OH]20ml，使溶解，加1%的草酸铵溶液80ml，混匀。

静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存。

4.1.8.3碘试液

取碘化钾[KI]2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片[I2]1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密闭棕色瓶中储存。

4.1.8.495％乙醇。

4.1.9溴麝香草酚蓝指示液

4.2培养基的种类

4.2.1营养肉汤培养基

4.2.2营养琼脂培养基

4.2.3胆盐乳糖培养基（BL）

4.2.44-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）

4.2.5乳糖培养基

4.2.65%乳糖培养基

4.2.7蛋白胨水培养基

4.2.8磷酸盐葡萄糖胨水培养基

4.2.9枸橼酸盐培养基

4.2.10曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）

4.3对照用菌液

取大肠杆菌[CMCC（B）44102]的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18~24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:

106，使对照菌液加入量含菌50~100个（一般用量为0.1m1），其菌数在做阳性对照的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。

4.4仪器与设备

4.4.1菌检室。

4.4.2净化工作台，恒温培养箱（36±1℃），微波炉，恒温水浴（45±1℃），高压蒸汽灭菌器，电冰箱，匀浆仪，离心机（500~4000转/分钟），显微镜（1500

倍），紫外灯（366nm）。

4.4.3薄膜过滤装置：

微孔滤膜直径约50mm，孔径0.45±0.02μm。

8.4锥形瓶（250~300ml，内装玻璃珠若干），研钵（陶瓷制，直径l0~12cm）、培养皿（9cm），量筒（100ml），试管（18⨯180mm）及塞，吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1），注射器（20ml或30ml），注射针头，载玻片，盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

4.4.4玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。

吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。

锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。

玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30分钟，烘干备用。

4.4.5大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70~75%乙醇溶液浸泡）。

4.4.6无菌衣、帽、口罩、手套。

洗净后配套，用牛皮纸包严，灭菌，备用。

4.4.7接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5mm、长度6~10cm），乙醇灯，乙醇棉球或碘伏棉球，灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子，灭菌钢锥，灭菌称样纸，不锈钢药匙，试管架，火柴，记号笔，白瓷盘，洗手盆，陶瓦盖（12cm）等。

所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照《菌检室物品进出标准操作程序》（SOPQC-003-00）进行操作。

4.5准备

4.5.1供试品的检验量

4.5.1.1所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位。

4.5.1.2固体制剂检验量为l0g。

4.5.1.3液体制剂检验量为l0ml。

4.5.1.4特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。

除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。

4.5.2供试液的制备

4.5.2.1液体供试品。

取供试品l0ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，摇匀，作为1:

10供试液。

4.5.2.2固体供试品。

称取供试品10g，置于匀浆杯或适当灭菌容器中，加入0.9%无菌氯化钠溶液100ml，用匀浆仪，振荡器或乳钵研磨等方法分散混匀。

4.5.2.3含抑菌成分供试品。

供试品按常规检查法，加入规定量的对照菌。

不能检出时，该供试液须按以下方法之一或两种以上方法联合处理后，依法检查。

同时做阳性和阴性对照。

4.5.2.3.1稀释法。

取规定量的供试液种入较大体积的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。

4.5.2.3.2离心沉淀集菌法。

取规定量的供试液于无菌刻度离心管中，3000转/分钟离心30分钟，移去上清液，留底部集菌液约2ml，并稀释该供试液至原规定量。

如有不溶性药渣，可先以500转/分钟离心5分钟，取全部上层液，再按上述方法集菌处理。

4.5.2.3.3薄膜过滤法。

取规定量的供试液于稀释剂100ml中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，过滤，用稀释剂冲洗滤膜，每次不少于100ml，将培养基加入滤器或取出滤膜，加入增菌培养基中。

4.5.2.3.4沉降法。

取规定量供试液，自然沉降5分钟，取上层液于100ml增菌液中，本法适用于难溶于水的抗菌制剂。

4.6检验程序

4.7增菌培养

取胆盐乳糖培养基（BL）3瓶，每瓶各100ml。

2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入对照菌50~100个作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。

37℃培养18~24小时（必要时可延至48小时）。

阴性对照应无菌生长。

摇匀上述BL增菌培养液，以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试

品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）管，37℃培养4、24小时后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后靛基质试液4~5滴于上述MUG管内，观察液面颜色。

MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色），报告检出大肠杆菌；MUG阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色），报告未检出大肠杆菌。

4.8分离培养

如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL。

增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线于EMB平板上，培养18~24小时，观察EMB平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。

当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于表1所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌。

表1大肠杆菌菌落形态特征

培养基

菌落形态

曙红亚甲蓝琼脂（EMB）

典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。

非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。

麦康凯琼脂

典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。

当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。

有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMVic试验。

4.9纯培养

如生长菌落与表1所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2~3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养18~24小时，作以下检查。

如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（紫黑色，或有金属光泽），应沾取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板，培养

18~24小时，再挑选单个疑似菌落，纯培养，作以下检查。

4.10革兰染色、镜检

4.10.1以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2~3次（载玻片不烫手）固定。

4.10.2滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗。

4.10.3滴加碘液，媒染1分钟，水洗，以滤纸吸干余水。

4.10.4滴加95%乙醇，脱色20~30秒钟，水洗。

4.10.5滴加沙黄染液，复染1分钟，待干后，镜检。

4.10.6染色结果

革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。

大肠杆菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。

4.10.7注意事项

4.10.7.1玻片必须洁净，涂片菌量宜少，菌不可浓。

否则，菌细胞成堆或连成片。

染色反应难于判断，菌细胞形态难于观察。

4.10.7.2培养物的菌龄以16~24小时为宜。

培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。

4.10.7.3脱色是关键，脱色时间不足菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。

4.11生化试验

4.11.1乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，培养24~48小时，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色；指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。

为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性，亦可接种5%乳糖发酵管。

绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24小时出现阳性。

或适当延长培养时间。

4.11.2靛基质试验

（1）

取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养24~48小时，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

98%的大肠杆菌靛基质试验为阳性。

一般24小时即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24小时，作靛基质试验。

4.11.3甲基红试验（M）

取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于培养液中加入甲基红指示液2~3滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或桔红色为阳性，呈黄色为阴性。

4.11.4乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）

取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2小时，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4小时（通常在30分钟）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。

4.11.5枸橼酸盐利用试验（C）

取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2~4天，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。

4.12结果判断

4.12.1当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MUG呈阳性，供试晶MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌。

MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌。

4.12.2MUG阳性、靛基质阴性、IMVic试验为–+––、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌；MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为++––、革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠杆菌。

4.12.3供试品培养物检查不符合9.6.2二项中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠杆菌。

4.12.4当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠杆菌，不能作出检验报告。

4.13注意事项

4.13.1MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。

除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性。

因此，在MUG培养基成分中增加丁去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰。

至于志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。

既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检出志贺菌、沙门菌。

4.13.2配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光；分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光。

4.13.3培养时间

供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4小时、24小时观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48小时再观察结果。

由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养时间、温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响。

4.13.4结果观察

取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。

供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。

如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管。

4.13.5药品中污染的大肠杆菌，易受生产工艺及药物的影响。

在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化，挑取可疑菌落往往凭经验，主观性较大，务必挑选2~3个以上菌落分别做IMVic试验鉴别，挑选菌落越多，检出阳性菌的机率越高，如仅挑选一个菌落做IMVic试验鉴别，则易漏检。

4.13.6在IMViC试验中，以灭菌接种针沾取菌苔，首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上，然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。

切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上，以免产生假阳性结果。

枸橼酸盐利用试验培养时间，原订为2天，根据试验资料，发现培养3天后，

枸橼酸盐利用试验产生阳性。

仅培养2天是不够的，故试验培养时间改为2~4天。

4.13.7阳性对照试验是检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。

阳性对照菌液的制备、计数及加入含供试品的培养基中等操作，不能在检测供试品的无菌室或净化台上进行，必须在单独的隔离间或净化台操作，以免污染供试品及操作环境。

4.13.8在各类供试品中检测大肠杆菌及其他控制菌，按一次检出结果为准，不再抽样复验。

检出的大肠杆菌及其他控制菌培养物须保留1个月，备查。