膜片钳知识竞赛真题精选.docx

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膜片钳知识竞赛真题精选

　　[填空题]1什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？

　　参考答案：

电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。

由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。

膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。

采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。

从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。

随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。

　　[填空题]2MultiClamp700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的rawoutput是否需要连接信号器的ANALOGIN接口？

　　scaledoutput，rawoutput有什么区别？

　　参考答案：

Rawoutput为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaledoutput为定标输出，输出的信号经过了处理。

后者的灵活度大，因此多采用。

目前膜片钳放大器多设有scaledoutput，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOGIN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Rawoutput了。

若你想记录两个输出，则需要将Rawoutput与数模转换器的另一个ANALOGIN连接。

　　[填空题]3在Clampex的Editprotocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？

　　参考答案：

Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。

而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用ramp。

　　[填空题]4inputresistance是什么意思？

如何测量？

　　参考答案：

在电生理学中，“inputresistance”指“输入膜电阻（Rin）”。

　　全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。

膜电阻（Rm）与膜输入阻抗Rin的关系为：

Rm＝4πr2Rin，r为细胞半径。

　　[填空题]5在一次电压钳全细胞记录中，是否每次一定要做电容消除、串连电阻补偿、漏减、和液接电位矫正？

　　参考答案：

在电压钳实验中，如果需要给予细胞电刺激来改变细胞膜电位（如超极化或去极化），则会出现膜的被动反应，产生电容电流与电阻电流，此时，前者需要用电容补偿消除，后者需要用漏减功能消除。

全细胞记录中，串联电阻是必须要补偿的（至少要补偿80%），除非它很小而忽略不计。

液接电位（一般在10mV左右）也需要校正，除非它很小。

你可采用Clampex软件中的菜单Tools/JunctionPotential功能对其测算，然后决定是否需要校正。

　　[填空题]6什么是尾电流，他主要反映通道的什么特性及用在那些方面？

　　参考答案：

　　[填空题]7如何理解steadystateactivation中的steadystate的意义？

　　参考答案：

　　“steadystate”是“稳态”的意思。

一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G，作出G-V曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线。

　　[填空题]8什么是Channelavailability？

　　参考答案：

Channelavailability指在排除失活情况下，能够开放的某通道的多少，通过全细胞电流幅度的大小来反映。

例如，海马神经元Na通道的channelavailability可因乙酰胆碱M受体的激活而降低，表现为Na通道电流幅度的降低。

　　[填空题]9使用Clampex

　　8.0记录配体门控离子通道电流，protocol如何设置？

　　参考答案：

需要事先在LabBench中设定好Channel序号和Signal名称。

在EditProtocol中选择Gap-free模式，采样频率可用5kHz，选好Input和Output。

先在Clampex中启动记录（Record），然后诱发电流，可用TimeTag作诱发标记。

　　[填空题]10消化分离海马锥体细胞时，应该通氧气吗？

　　参考答案：

不用通氧，直接放入CO2孵箱里就行了。

电极内液应该过滤完分装入EPPENDORF管，用时再拿出来。

尽量避免污染。

另外，环境中的灰尘也要考虑。

细胞外液要及时清洗。

　　[填空题]11全细胞破膜以后串联电阻总是在不断上升，膜渐渐的又融合起来了。

有什么办法解决吗？

　　参考答案：

串联电阻上升是由于破膜不完全，或者电极内液有污染堵塞电极所至。

　　解决方法：

适当增大电极的口径，以利于破膜；电极内液使用前一定用

　　0.22目滤器过滤；灌注电极液的器具也要保持洁净；电极现用现拉；电极下降入细胞外液时给予一定的正压防止此过程中灰尘堵塞电极。

　　[填空题]12什么是膜片钳技术？

它的基本工作原理是什么？

　　参考答案：

膜片钳技术是一种能够记录膜结构中单一的离子通道蛋白质的开放和关闭的技术，即是测量单通道离子电流和电导的技术。

基本工作原理：

膜片钳技术是用玻璃微电极接触细胞，形成吉欧姆（GΩ）阻抗，使得与电极尖端开口处相接的细胞膜的膜片与周围在电学上绝缘，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。

　　[填空题]13膜片钳实验的基本操作步骤包括哪些？

　　参考答案：

　　1、液体配制：

主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保持两个平衡：

渗透压平衡和酸碱平衡。

所有液体在使用前必须过滤。

　　2.标本制备

　　3.记录

　　4、资料分析：

（1）一般电学性质：

通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。

通过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。

（2）动力学：

开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与关闭类型（簇状猝发（Burst）样开放与闪动样短暂关闭（flickering）），化学门控性通道的开、关速率常数等。

　　（3）通过对全细胞激活曲线或失活曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率因子K。

　　（4）药理学：

阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。

　　（5）综合分析得到最后结论。

　　[填空题]14膜片钳记录方法分为哪四类？

各有何特点？

　　参考答案：

膜片钳的四种工作模式

　　1.细胞贴附式（cell-attached）

　　2.全细胞模式（whole-cellrecording）

　　3.内面向外式（inside-out）

　　4.外面向外式（outside-out）

　　[填空题]15建立膜片钳记录系统大致需要哪些基本设备？

　　参考答案：

膜片钳实验仪器设备主要有放大器、微型操纵器（微超）、倒置显微镜、防震台、屏蔽笼、灌流槽和数据采集和处理设（计算机）。

其中膜片钳放大器（amplifier）、微型操纵器（微操micromanipulator）、倒置显微镜（invertedmicroscope）是膜片钳实验区别于一般电生理实验所需要的仪器。

　　[填空题]16使用打孔全细胞膜片钳记录（perforatedwhole-cellpatchclamprecording）的优点是什么？

　　参考答案：

打孔全细胞记录的优点：

　　1）克服了细胞内微电极高阻抗，需刺破细胞膜进入细胞，造成胞浆流失，破坏细胞生理功能完整性的缺点，记录是在一个相对完整的神经结构上进行；

　　2）电极以一个低电阻进入细胞内，这样就可以较好的控制膜电位，另外由于电极与细胞膜形成的高阻封接，这就可较好地显示细胞固有的膜特性；

　　3）由于电极尖端比较大，很易改变电极内溶液，以便控制细胞内环境，很易注入一些蛋白或酶至细胞内。

　　4）用一般常规微电极很难在比较小，年幼的神经元上作记录，而全细胞记录适合研究各种神经制备，各种类型的神经元。

　　[填空题]17如何判断膜片钳记录过程中已经形成良好的细胞封接？

　　参考答案：

在电极入液之前，给它施加一个较大的正压，有助于迅速形成良好的封接。

电极入液后，液接电阻可以不补偿，当封接形成之后自然会消失。

　　电极刚入水时测试脉冲所引起的电流呈方波，其幅度与电极电阻成反比。

电极尖端轻微触压细胞膜，电阻略有增大，噪声略有降低。

形成封接后，电流方波几乎消失，噪声也急剧下降，两个尖峰是快电容引起的电流。

　　为证实封接的形成，可以增加放大器的增益，从而可以观察到除脉冲电压的首尾两端出现电容性脉冲尖端电流之外，电流波形仍呈平坦状。

　　[填空题]18在Clampex的Editprotocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？

　　参考答案：

　　Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。

而像钠通道，其衰减非常迅速，在持续去极化的情况下，通道很快失活，无法使用ramp，另外诸如烟碱受体通道等具有明显失敏特征的受体通道也不宜采用ramp。

　　[填空题]19inputresistance是什么意思？

如何测量？

　　参考答案：

在电生理学中，“inputresistance”指“输入膜电阻（Rin）”。

　　全细胞记录时，给细胞膜施加一系列刺激方波（一般为超极化），在离子通道没有开放的情况下测定跨膜电流，根据欧姆定律即可求出Rin。

膜电阻（Rm）与膜输入阻抗Rin的关系为：

Rm＝4πr2Rin，r为细胞半径

　　[填空题]20如何理解steadystateactivation中的steadystate的意义？

　　参考答案：

　　“steadystate”是“稳态”的意思。

一般通过给予细胞持续一定时间的一系列去极化（多为去极化）脉冲来激活离子通道，记录通道电流峰值，再计算岀电导G，作出G-V曲线，该曲线称为稳态激活曲线，也就是我们常说的激活曲线

　　[填空题]21膜片钳实验的主要影响因素是什么？

　　参考答案：

减少噪音，避免电极前端的污染，封接的成功与否，选取正确的记录模式，如何选择电极内、外液，如何选择激动剂、阻断剂，正确的进行数据采集更多内容请访问《睦霖题库》微信公众号

　　[填空题]22传统的全细胞膜片钳记录（conventionalwhole-cellpatchclamprecording）过程中怎样进行质量控制？

Qualitycontrol质量控制

　　参考答案：

　　1.开始封接的电阻必须大于1兆欧。

　　2.整个记录过程中，电阻必须低于20M。

　　3.如果在正常高钾溶液内使用，膜电位必须低于-50mV。

　　4.细胞的电容和电阻必须是稳定的

　　[填空题]23膜片钳技术的应用范围有哪些？

　　参考答案：

　　1）分辨单通道电流，直接观察通道的开闭过程。

　　2）区分离子通道的离子选择性及其门控性（如区分电压或化学门控性通道），发现新的离子通道及亚型。

　　3）在记录单个通道电流（i）和全细胞电流（I）的基础上，可分别计算出细胞膜上的通道数（n）和开放概率（p），依公式I=nip。

　　4）用以检测某些递质能否打开通道，或是否接受第二信使的调控（膜内面向外式）5）研究细胞膜上的信使物质对离子通道型受体的调节机制（应用全细胞记录式）6）研究不同离子对通道特性的影响及细胞内信使物质如对离子通道型受体的调节机制（内面向外膜片）7）研究药物对电压或化学门控性通道的影响。

　　[填空题]24破膜以后封接电阻有所降低的话，会不会影响记录到的动作电位？

　　参考答案：

通常情况下offset调0，是在zero程序下，holding在0，给一个5-10mv，持续2ms的电压刺激，然后用offset补偿电极尖端电位。

axon破膜后电阻当然会下降，根据我的经验瞬时电阻应在100M以上，之后会上升，以稳定在500M以上的为佳，越高越好。

　　[填空题]25什么是漏电流，为什么要做Leaksubtraction？

　　参考答案：

漏电流的概念比较混乱，可以指封接电流（封接时从封接处“漏掉”的电流），也可指放大器的系统偏差，还可指膜漏电流。

一般来讲，膜漏电流是细胞膜的被动反应电流，是非离子通道电流，因此在记录离子通道电流时要将它去除。

膜片钳放大器与采样分析软件都具有将其去除的漏减功能。

　　[填空题]26电极拉制程序中具体应该如何控制。

在参数设定的摸索中，是否需要每次都用显微镜检测，还是另有更易操作的方法.

　　参考答案：

　　[填空题]27Decay是什么意思？

和inactivation有何区别？

　　参考答案：

Decay是“衰减”之意，inactivation是“失活”之意，但在文献中经常混用，decay也常常被说成失活，例如钙电流的衰减常被说成失活，这样用也没什么问题。

但实际上，两者细分的话还是有区别的。

可以将Inactivation分为稳态失活与非稳态失活。

后者即Decay，是指在刺激因素（电位变化、施加药物等）持续存在下通道的失活，而稳态失活（Steadystateinactivation）一般是指将膜电位钳制在不同的水平，然后观察通道的失活情况，做出失活曲线。

　　[填空题]28什么是ramp？

有什么作用？

　　参考答案：

与步阶（step）不同，ramp在pClamp软件中表示施加给细胞的一种逐渐变化的电压或电流，称为“斜坡电压或电流”，可用于作通道I-V曲线。

　　[填空题]29离子通道电导的单位是什么？

如何换算？

　　参考答案：

离子通道电导的单位是西门子（Siemens,S），旧称姆欧，即安培/伏特。

常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12S，1,000pS＝1pA/mV。