核酸的性质.docx
《核酸的性质.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸的性质.docx（13页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
核酸的性质
核酸的性质
核酸的性质
核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂，本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。
一、一般物理性质
1.溶解度DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，它们都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。
它们可溶于2-甲氧乙醇，但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂，因此，常用乙醇从溶液中沉淀核酸，当乙醇浓度达50%时，DNA就沉淀出来，当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同，DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液，可溶于高浓度（1~2mol/L）的NaCl溶液，而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液，因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。
2.分子大小DNA分子极大，分子量在106以上，RNA的分子比DNA分子小得多。
核酸分
降的速率有很大差异，所以可以用超离心法纯化核酸，或将不同构象的核酸进行分离，也可以测定核酸的沉降常数与分子量。
应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时，效果较好。
RNA分离常用蔗糖梯度。
分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。
氯化铯在水中有很大的溶解度。
可以制成浓度很高（8mol／L）的溶液。
应用啡啶溴红—氯化铯密度梯度平衡超离心，很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。
这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。
如果应用垂直转头，当转速为65000r/min（BeckmanL-70超离心机），只要6h即可以完成分离工作。
但是如果采用角转头，转速为45000r/min时，则需36h。
离心完毕后，离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚（图3-26）。
蛋白质漂浮在最上面，RNA沉淀在底部。
超螺旋DNA沉降较快，开环及线形DNA沉降较慢。
用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA区带部位刺入，收集这一区带的DNA。
用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料，然后透析除CsCl，再用苯酚抽提1~2次，即可用乙醇将DNA沉淀出来。
这样得到的DNA有很高的纯度，
可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱等。
在少数情况下，需要特别纯的DNA时，可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。
四、核酸的两性解离及凝胶电泳
核酸既含有呈酸性的磷酸基团，又含有呈弱碱性的碱基，故为两性电解质，可发生两性解离。
但磷酸的酸性较强，在核酸中除末端磷酸基团外，所有形成磷酸二酯键的磷酸基团仍可解离出一个H+，其pK为1.5；而嘌呤和嘧啶碱基为含氮杂环，又有各种取代基，既有碱性解离又有酸性解离的性质，解离情况复杂，但总的来看，它们呈弱碱性。
所以，核酸相当于多元酸，具有较强的酸性，当pK>4时，磷酸基团全部解离，呈多阴离子状态。
核酸是具有较强的酸性的两性电解质，其解离状态随溶液的pH而改变。
当核酸分子的酸性解离和碱性解离程度相等，所带的正电荷与负电荷相等，即成为两性离子，此时核酸溶液的pH就称为等电点（isoelectricpoint,简称pI）。
核酸的等电点较低，如酵母RNA的pI为2.0~2.8。
根据核酸在等电点时溶解度最小的性质，把pH调至RNA的等电点，可使RNA从溶液中沉淀出来。
根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是电泳（electrophoresis）。
凝胶电泳可算是当前核酸研究中最常用的方法了。
它有许多优点：
简单、快速、灵敏、成本低。
常用的凝胶电泳有琼脂糖（agarose）凝胶电泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳。
可以在水平或垂直的电泳槽中进行。
凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率很高。
（一）琼脂糖凝胶电泳
以琼脂糖为支持物。
电泳的迁移率决定于以下因素：
1.核酸分子大小迁移率与分子量对数成反比；
2.胶浓度迁移率与胶浓度成反比。
常用1%胶分离DNA；
3．DNA的构象一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快，线形DNA其次，开环形最慢。
但在胶中加入过多的啡啶溴红时，上述分布次序会发生改变；
4．电压一般不大于5V／cm。
在适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比；
5．碱基组成有一定影响，但影响不大；
6．温度4~30℃都可，常在室温。
琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。
由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶（RNase）杂质，所以用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等，以使核糖核酸酶变性。
电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色（0.5μg／ml）。
啡啶溴红为一扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。
DNA与啡啶溴红结合后，经紫外光照射，可发射出红—橙色可见荧光。
0.1μgDNA即可用此法检出，所以此法十分灵敏。
可根据荧光强度可以大体判断DNA样品的浓度。
若在同一胶上加一已知浓度的DNA作参考，则所测得的样品浓度更为准确。
可以用灵敏度很高的负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来，作进一步分析与长期保留。
图3-27即为凝胶电泳图谱。
应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。
实用的方法是在同一胶上加一已知分子量的样品（如图3-27中的λDNA／HindⅢ的片段）。
电泳完毕后，经啡啶溴红染色、照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近，即可推算出未知样品中各片段的大小。
目前许多试剂公司都能提供各种不同分子量的标准样品。
凝胶上的样品，还可以设法回收，以供进一步研究。
回收的方法很多，可参考其他资料。
最常用的方法是在紫外光照射下将胶上某一区带切割下来，切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水平电泳槽中进行电泳，使胶上的DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳3~4小时后，将电极倒转，再通电30~60s，粘在壁上的DNA重又释放到缓冲液中。
取出透析袋内的缓冲液（丢弃胶条），用苯酚抽提1~2次，水相用乙醇沉淀。
这样回收的DNA纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、序列分析或作末端标记。
回收率在50%以上。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳
以聚丙烯酰胺作支持物。
常用垂直板电泳。
单体丙烯酰胺在加入交联剂后，就成聚丙烯酰胺。
由于这种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分析分子量小于1000bp的DNA片段。
聚丙烯酰胺中一般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。
但仍要留心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。
聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低的核酸样品不能用此法检测出来。
五、核酸的变性、复性
（一）变性
变性（denaturation）作用是核酸的重要物化性质。
核酸的变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链的无规则线团，使核酸的某些光学性质和流体力学性质发生改变，有时部分或全部生物活性丧失（图3-28），并不涉及共价键的断裂。
多核苷酸骨架上共价键（3',5'-磷酸二酯键）的断裂称核酸的降解。
降解引起核酸分子量降低。
当将DNA的稀盐溶液加热到80~100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链分开，形成无规则线团。
一系列物化性质也随之发生改变：
粘度降低，浮力密度升高等，同时改变二级结构，有时可以失去部分或全部生物活性。
DNA变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积已不存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，这样就使得变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变性前明显升高（增加），这种现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。
常用增色效应跟踪DNA的变性过程，了解DNA的变性程度。
可以引起核酸变性的因素很多，如加热、极端的pH、有机溶剂、酰胺、尿素等。
由温度升高而引起的变性称热变性。
由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性。
尿素是用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定DNA序列常用的变性剂。
甲醛也常用于琼脂糖凝胶电泳法测定RNA的分子大小。
DNA变性的特点是爆发式的。
当病毒或细菌DNA分子的溶液被缓慢加热进行DNA变性时，溶液的紫外吸收值在到达某温度时会突然迅速增加，并在一个很窄的温度范围内达到最高值。
其紫外吸收增加40%，此时DNA变性发生并完成。
DNA热变性时，其紫外吸收值到达总增加值一半时的温度，称为DNA的变性温度。
由于DNA变性过程犹如金属在熔点的熔解，所以DNA的变性温度亦称为该DNA的熔点或熔解温度（meltingtemperature），用Tm表示。
DNA的Tm值一般在70~85℃之间（图3-29），常在0.15mol/LNaCI，0.015mol/L柠檬酸三钠（sodiumchloride-sodiumcitrate,SSC）溶液中进行测定。
DNA的Tm值大小与下列因素有关：
1．DNA的均一性
均一性愈高的DNA样品，熔解过程愈是发生在一个很小的温度范围内。
2．G≡C的含量
G≡C含量越高，Tm值越高，二者成正比关系（图3-30）。
这是因为G≡C对比A=T对更为稳定的缘故。
所以测定Tm值可推算出G≡C对的含量。
其经验公式为：
G≡C%=（Tm–69.3）×2.44
3．介质中的离子强度
一般说离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，熔解温度的范围较宽。
而在较高的离子强度的介质中，情况则相反（图3-31）。
所以DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液或溶液中。
常在1mol／LNaCl中保存。
RNA分子中有局部的双螺旋区，所以RNA也可发生变性，但Tm值较低，变性曲线也不那么陡。
（二）复性
变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合（reassociation）成为双螺旋结构的过程称为复性（renaturation）。
DNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性也可以得到部分恢复。
复性过程基本上符合二级反应动力学，其中第一步是相对缓慢的，因为两条链必须依靠随机碰撞找到一段碱基配对部分，首先形成双螺旋。
第二步快得多，尚未配对的其他部分按碱基配对相结合，象拉锁链一样迅速形成双螺旋。
反应的进行与许多因素有关。
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性，例如用同位素标记的双链DNA片段进行分子杂交时，为获得单链的杂交探针，要将装有热变性DNA溶液的试管直接插入冰浴，使溶液在冰浴中骤然冷却至0℃。
由于温度降低，单链DNA分子失去碰撞的机会，因而不能复性，保持单链变性的状态，这种处理过程叫“淬火”（guench）。
热变性DNA在缓慢冷却时，可以复性，这种复性称为退火（annealing）。
DNA的片段越大，复性越慢。
DNA的浓度越大，复性越快。
在一定条件下，复性反应的速度可以用Cot来衡量。
Co为变性DNA的原始浓度，以核苷酸的摩尔浓度表示，t为时间，以秒表示。
实验证明，两种浓度相同但来源不同的DNA，复性时间的长短与基因组的大小有关（图3-32）。
具有很多重复序列的DNA，复性也快。
DNA复性后，其溶液的A260值减小，最多可减小至变性前的A260值，这现象称减色效应（hypochromiceffect）。
引起减色效应的原因是碱基状态的改变，DNA复性后其碱基又藏于双螺旋内部，碱基对又呈堆积状态，它们之间介电子的相互作用又得以恢复，这样就使碱基吸收紫外光的能力减弱。
可用减色效应的大小来跟踪DNA的复性过程，衡量复性的程度。
（三）核酸的杂交（hybridization）
根据变性和复性的原理，将不同来源的DNA变性，若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则退火条件下能形成DNA-DNA异源双链，或将变性的单链DNA与RNA经复性处理形成DNA-RNA杂合双链，这种过程称为分子杂交（molecularhybridization）。
核酸的杂交在分子生物学和分子遗传学的研究中应用极广，许多重大的分子遗传学问题都是用分子杂交来解决的。
核酸杂交可以在液相或固相上进行。
目前实验室中应用较广的是用硝酸纤维素膜作支持物进行的杂交。
英国的分子生物学家E．M．Southern所发明的Southern印迹法（southernblotting）就是将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜上后再进行杂交的。
这里以DNA-DNA杂交为例，较详细地介绍Southern印迹法。
将DNA样品经限制性内切酶降解后，用琼脂糖凝胶电泳进行分离。
将胶浸泡在碱（NaOH）中使DNA变性，并将变性DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA!
），在80℃烤4~6h，使DNA牢固地吸附在纤维素膜上。
然后与放射性同位素标记的变性后DNA探针进行杂交。
杂交须在较高的盐浓度及适当的温度（一般68℃）下进行数小时或十余小时，再通过洗涤，除去未杂交上的标记物。
将纤维素膜烘干后进行放射自显影。
全部过程见图3-33。
除了DNA外，RNA也可用作探针（probe）。
用32P标记核酸时（用作探针），可以在3'，或5'末端标记，也可采用均匀标记。
应用类似的方法也可分析RNA，即将RNA变性后转移到纤维素膜上再进行杂交。
此方法称Northern印迹法（Northernblotting）。
不同来源的核酸链的杂交形成了近代分子遗传学许多重要实践技术的基础。
在有一段合适的互补DNA单链的情况下（通常对这个DNA链进行适当的标记），通过杂交可以在许多其他DNA顺序存在时检出一个特殊DNA序列或基因。
应用核酸杂交技术，可以将含量极少的真核细胞基因组中的单拷贝基因钓出来。
六、核酸的酸解、碱解与酶解
核酸在酸、碱和酶的作用下，发生共价键断裂，多核苷酸链被打断，分子量变小，此过程称为降解。
下面简要讨论酸、碱和酶对核酸的降解作用。
（一）酸解
酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间长短而不同。
用温和的或稀的酸作短时间处理，DNA和RNA都不发生降解。
但延长处理时间或提高温度，或提高酸的强度，则会使核酸中的部分糖苷键发生水解，先是嘌呤碱基被水解下来，生成无嘌呤的核酸，同时少数磷酸二酯键也发生水解，使链断裂。
若用中等强度的酸在100℃下处理数小时，或用较浓的酸（如2~6mol/LHCl）处理，则可使嘧啶碱基水解下来，更多的磷酸二酯键断裂，核酸降解程度增加。
（二）碱解
RNA在稀碱条件下很容易水解生成2'-核苷酸和3'-核苷酸。
因为RNA中的核糖具有2'-OH，在碱催化下3',5'-磷酸二酯键断裂，先形成中间物2',3'-环核苷酸，它不稳定而进一步水解，生成2'-核苷酸和3'-核苷酸的混合物。
反应过程见图3-34。
RNA碱解所用的KOH（或NaOH）的浓度可因温度和作用时间而不同，如1mol/LKOH（或NaOH）在80℃下作用1h，或0.3mol/LKOH（或NaOH）在37℃下作用16h均可以使RNA水解成单核苷酸。
在同样的稀碱条件下，DNA是稳定的，不会被水解成单核苷酸，因为DNA中的脱氧核糖C2'位没有-OH，不能形成2',3'-环核苷酸。
DNA在碱的作用下，只发生变性，不发生磷酸二酯键的水解。
根据碱对DNA和RNA的不同作用，可用碱解法从RNA制取2'-和3'-核苷酸；用碱处理DNA和RNA混合液，使RNA水解成单核苷酸保留在溶液中，再把DNA从溶液中沉淀下来，分别进行定量测定。
图3-34RNA碱解反应过程
（三）核酸的酶解
1.核酸的酶法水解与核酸酶的分类
能水解核酸的酶称为核酸酶（nucleases）。
实际上所有的细胞中都含有各种核酸酶。
它们参加正常的核酸代谢过程。
有些器官如胰脏，可以提供含有大量核酸酶的消化液以水解食物中的核酸。
核酸酶都是“磷酸二酯酶”（phosphodiesterases），它们催化在水参与下磷酸二酯键的断裂。
由于核酸链是由两个酯键将核苷酸连接而成的，核酸酶切割磷酸二酯键的位置不同会产生不同的末端产物。
核酸酶分为内切核酸酶（endonuclease）和外切核酸酶（exonuclases）。
外切核酸酶只从一条核酸链的一端逐个切断磷酸二酯键释放单核苷酸。
而内切核酸酶在核酸链的内部切割核酸链，产生核酸片段（参见第九章）。
与大部分的酶一样，核酸酶对它们作用底物的性质表现出选择性或特异性。
有些核酸酶只作用于DNA，称为脱氧核糖核酸酶（DNases），而有些核酸酶只作用于RNA，称为核糖核酸酶（RNases）。
既能水解DNA亦能水解RNA的称非特异性核酸酶，例如两种非特异性核酸酶蛇毒磷酸二酯酶和脾磷酸二酯酶，它们在特异性上是互补的，蛇毒磷酸二酯酶以游离的3'-OH末端开始切割产生5'-单磷酸核苷，而脾磷酸二酯酶从游离的5'-OH末端开始切割产生3'-单磷酸核苷。
核酸酶还表现出对二级结构的特异性，有些核酸酶只水解单链核酸；有些则只水解双链核酸。
有些核酸酶选择核酸链含某一碱基的核苷酸处切割核酸链（碱基特异性）；有些则要求切割点具有4~8个核苷酸残基的特殊核苷酸顺序，对分子生物学家来说，核酸酶是在实验室中切割和操作核酸的工具。
2.限制性内切酶
限制性内切酶（restrictionendonuclease）也称限制性酶（restrictionenzyme），是由W.Arber，H.Smith和D.Nathans等人（1979年）从细菌中分离的一类酶。
限制酶具有极高的专一性，识别双链DNA上特定的位点，将两条链都切断，形成粘末端或平末端。
限制酶可以用来解剖纤细的DNA分子，在分析染色体结构、制作DNA的限制酶谱、测定较长的DNA序列、基因的分离、基因的体外重组等研究中是不可缺少的工具。
对于研究DNA的分子生物学家来说，这是一把天赐神刀——分子生物刀。
限制性酶的生物学功能在于防御或“限制”入侵细胞的外DNA（如噬菌体DNA）。
原核生物利用他们独特的限制性内切酶把外来DNA切成无感染性的片段。
但不能降解自身细胞中的染色体DNA，因为细胞内还有“共座”的DNA甲基化酶修饰相应序列使之受到保护。
限制酶可被分成三种类型。
I型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亚基有通过在特殊碱基上补加甲基基团对DNA进行化学修饰的活性。
I型限制性内切酶在随机位点切割DNA；Ⅲ型限制酶识别双链DNA的特异核苷酸序列，并在这个位点内或附近切开DNA双链。
Ⅱ型限制性内切酶已被广泛应用于DNA分子的克隆和序列分析，这是因为它们水解DNA不需要ATP，并且也不以甲基化或其他方式修饰DNA。
最重要的是它们在它们所识别的特殊核苷酸顺序内或附近切割DNA链。
这些特殊序列常常含4个或6个核苷酸残基，通常具回文结构（palindromicstructure），切割后形成粘末端（或平末端）。
例如，大肠杆菌的一限制酶称EcoRI，它识别下列六核苷酸顺序：
5'……GAATTC……3'
3'……CTTAAC……5'
这种回文结构的两条链以5'→3'方向阅读序列都是一样的结构，当EcoRI遇到DNA的这种序列时，它会对这种DNA链进行交错切割，产生突出的5'末端。
5'……GAATTC……3'
3'……CTTAAC……5'
有些限制酶，如PstI，它识别序列5'-CTGCAG-3'，并在A与G之间切割DNA双链产生3'突出粘性末端。
还有些限制酶，如BalI，DNA链产生具有平末端（bluntend）的DNA片段。
限制酶的命名较为特殊。
以EcoRI为例加以说明。
第一个大写字母E为大肠杆菌E.coil的属名的第一个字母，第二、三两个小写字母co为它的种名的头两个字母。
第四个字母用大写R，表示所用大肠杆菌的菌株。
最后一个罗马字表示从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。
目前提纯的限制酶已很多，常用的约有100多种，并且已转化成为商品。
大大节约了研究人员的时间。
3. DNA的限制酶图谱
在研究某一种DNA时，弄清楚这种DNA分子有哪些限制酶切点是很重要的，这就是制作DNA的限制酶图谱（restrictionmap）。
建立限制酶图谱是进一步深入分析此DNA的基础。
图谱的制作十分简单。
将纯化的DNA（往往用分子克隆法，从单一克隆中扩增而制备）用不同的限制酶切割，进行凝胶电泳分析。
对环形DNA要先找出一个对该DNA只有一个切点的酶，以此点作为参考点。
根据测量凝胶电泳图上各酶切片段的长度，就可以决定各切点的位置。
有时，需要用两种酶相继降解，有时需要用一种酶部分降解才能决定其酶切位点的位置。
如果将DNA的一端（3'，或5'端都可）先进行放射性同位素标记，再用不同酶分头切割（完全降解，部分降解或双酶相继降解），各切点位置的决定就要容易得多了。
图3-35为一种小分子环形DNA分子质粒pBR322DNA的限制酶图谱（参阅第十章）。
此图表明限制图实际上是各种限制性内切酶在某一DNA分子上或DNA片段上切点的排列。
由于各种酶切位点之间的距离是以碱基对表示的[对大的染色体DNA则以千碱基对（kilobasepair,kb）或百万碱基对（Mb）表示，也可计算出两切点间的绝对距离，因此，限制图也称物理图谱。
升级会员 