HPβCD包合百里香挥发油的实验研究.docx

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HPβCD包合百里香挥发油的实验研究

HP-β-CD包合百里香挥发油的实验研究

[摘要]目的：

采用正交试验法优选百里香挥发油-HP-β-CD包合物的制备工艺。

方法：

采用正交试验设计，以HP-β-CD与挥发油的用量配比（V：

W）、包合温度、搅拌时间、HP-β-CD浓度为考察因素，以挥发油利用率、包合物含油率和包合物收得率进行综合评分，采用水溶液法优选制备百里香挥发油-HP-β-CD包合物的工艺。

结果：

最佳包合条件为：

挥发油：

HP-β-CD（V：

W）=1：

10，搅拌时间2h，包合温度为30℃,HP-β-CD浓度为5%。

结论：

此工艺可提高制剂稳定性，方法简便易行，能适用于大生产。

[关键词]百里香；挥发油；HP-β-CD；包合物；正交试验

StudyonthePreparationofHP-β-cyclodextrinInclusionCompoundsofVolatileOilExtractedfromThymusmongolicusRonnbyOrthogonalTest

ABSTRACT:

OBJECTIVETooptimizethepreparationtechnologyofHP-β-cyelodextrin（HP-β-CD）inclusioncompoundofvolatileoilinThymusmongolicusRonnbytheorthogonaldesign。

METHODSUsingthreeindexesincludingtheusingamountandratioofvolatileoiltoHP-β-CD（V：

W），inclusiontemperature，stirringtimeand（HP-β-CD）concentrationfortheinvestigationfactors，tocomprehensivelyevaluatethevolatileoilutilizationefficiencyandinclusionyield．ThewatersolutionmethodwasusedtooptimizethetechnologyforpreparingHP-β-cyelodextrininclusioncompound．RESULTSTheoptimuminclusionconditionwasthatvolatileoil：

HP-β-cyelodextrin（HP-β-CD）inproportionas1：

8wasmixed，andtriturated2hours，30℃，HP-β-cyelodextrin（HP-β-CD）concentrationof5%。

CONCLUSIONThisprocesscanimprovepreparationstability，andthemethodisconvenientandcanbeappliedtolarge-scaleproduction．

KEYWORDS:

thymusmongolicusRonn;Volatileoil;HP-β-cyclodextrins（HP-β-CD）;inclusioncompound;orthogonaltest

1引言

百里香（ThymusmongolicusRonn.）,又名:

地椒、地花椒、山椒、山胡椒、地姜、千里香。

百里香既是药用植物,又是经济植物，原产于地中海沿岸,全球约有300-400种,广泛分布在北非、欧洲和亚洲温带地区,经济栽培以南欧最多[1]，我国有11种，2个变种，分布于新疆、青海、西藏及黄河流域及以北地区[2]。

百里香是一种颇具开发价值的多用途植物，可作为芳香疏菜、药用植物、香料作物、蜜源植物、观赏植被及干旱土壤的水上保持植物被大面积种植[3]。

但挥发油有见光易氧化分解、易于在制剂的生产、贮藏过程中散失等缺点而影响药效。

采用羟丙基-β-环糊精包合可以避免药效损失，并可使之粉末化、微囊化而改变其物理性状，且能提高水溶性，便于固体制剂的制备及其稳定性。

羟丙基-β-环糊精包合挥发油较成熟的方法有搅拌法、研磨法、饱和水溶液法、超声法等，其中水溶液法具有挥发油包合物收率高、省工时的优点，为了更好地发挥百里香挥发油的治疗作用，提高其稳定性和水溶性，减少散失，本研究采用正交设计法对百里香挥发油羟丙基-β-环糊精包合工艺条件进行了优化，确立了最佳工艺条件，利用紫外光谱分析法、傅里叶变换红外分析法对包合物进行表征，利用气相色谱-质谱联用技术测定了百里香挥发油的化学成分，为百里香挥发油的开发利用提供依据。

1.1百里香的食用价值

百里香作为一种香辛疏菜，早在古罗马时期就已应用于人们的生活。

在西方，百里香是一种家喻户晓的香草；在我国，百里香自古就有栽培，明朝李时珍在《本草纲目》中“味微辛、上人以之煮羊肉食,香矣”的记述，但主要是作为香辛疏菜，用做调味品，用量较少，一直没有受到应有的重视。

百里香在烹饪中主要用的是茎和叶片，鲜叶、嫩尖或其干制品与其它芳香料混合，可为菜肴增香，特别适宜烤肉及烤野味类，与海鲜类原料也是很好的组合，其淡雅的香气为各种新鲜鱼肉虾贝类等海产品添加独特的清香，同时也有矫腥除臭的作用。

百里香的天然防腐作用还使其成为肉酱、香肠、腌肉和泡菜的绿色无害的香料添加剂。

在民间，生鲜百里香或干燥之后可单独用作茶饮。

1.2百里香的药用价值

1.2.1百里香全草药用价值

百里香全株可入药,可用于治疗痉挛性咳嗽、白口咳,炎症、流行性感冒、喉头肿痛，具有驱风、止咳化痰、温中散寒、健脾消食之功效。

《中药大辞典》中记载[4]：

百里香的花煎剂流浸膏可以用于支气管炎或上呼吸逍疾病的防治，也可用于神经炎或脊神经根炎门痛之用。

我国民间常用百里香干燥全草置于衣柜内或放于床下，做衣服、皮毛制品及毯毡的防虫物，也可将干草搓绳点燃于室内熏杀蚊虫。

百里香具有抗菌的效果,含有缓解止痛成分，也能加强免疫系统功能，对神经系统具有镇静的作用。

1.2.2百里香挥发油的药用价值[5-6]

百里香挥发油中百里香酚的含量最大，百里香挥发油具有抗氧化、抗菌、抗炎、防止血栓形成以及减缓身体器官组织衰老等重要作用，许多品种百里香挥发油还显示出镇咳、抗菌、消毒、抗微生物、提神、摧眠、镇静等疗效作用,也可应用于烟草行业中[7]，某些品种的挥发油还具有一定的抗肿瘤作用。

近年来，国内外对百里香植物化学成分的研究较多,获得了许多具有开发前途的成分，并将其应用于医疗、保健、化妆品、食品等方面。

2仪器与试药

2.1仪器

JRA-6数显磁力搅拌水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；LGJ-18S冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；ARll40型电子分析天平（奥豪斯国际贸易上海有限公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；挥发油提取器（华东医药器化有限公司）；紫外分光光度计UA-1000（）；IS-10型傅里叶红外光谱仪（美国热电公司）；气相色谱-质谱联用仪（FocusGC-PolarisQ,美国热电公司）。

2.2药品

HP-β-CD（上海杉普化工有限公司）；百里香（甘肃省中药材公司）；无水乙醇（烟台市双双化工有限公司）；石油醚（天津市德恩化学试剂有限公司）；试剂均为分析纯。

3方法结果

3.1百里香挥发油的提取（水蒸汽蒸馏法）[8]

在圆底烧瓶中加入干燥的百里香（粉碎程度≦1.5cm）150g和4倍蒸馏水，充分浸泡3h；连接挥发油提取器，缓缓加热至微沸，保持4h，收集油层。

重复上述步骤2次，合并挥发油，用石油醚（沸程30~60℃）萃取，合并有机层，加入少量无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除石油醚得黏稠状黄色色油状液体（具有很强的芳香性气味），干燥后放置阴冷处，避光密封保存，待用。

3.2指标确定[8]

3.2.1挥发油的空白回收率的测定

准确称取适量挥发油置于圆底烧瓶中,加入适量蒸馏水进行蒸馏，至油量不再增加，停止加热，收集挥发油即得挥发油的空白回收率。

本实验空白回收率为91.2%。

3.2.2挥发油收得率、包合率、含油率的测定

将制得的包合物置烧瓶中，加入蒸馏水适虽，提取挥发油至油量不再增加，停止加热，即得包合物实际含油量。

3.3百里香挥发油-HP-β-CD包合物的工艺设计

根据预实验和参考文献[9-12]影响环糊精包合的主要因素是挥发油（mL）与HP-β-CD（g）的比例（A）、搅拌时间（B）、包合温度（C）及HP-β-CD浓度（D）为考察因素，以综合评分为评价指标，取3水平，用L9（34）正交试验表安排试验。

见表1，实验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1HP-β-CD包合百里香挥发油工艺L9（34）正交试验因素水平表

Tab.1FactorsandlevelsoforthogonaltestoninclusionofvolatileoilwithHP-β-CD

水平

A

B

C

D

HP-β-CD浓度（%）

挥发油（mL）：

HP-β-CD（g）

包合温度（℃）

搅拌时间（h）

1

2

3

1:

6

1:

8

1:

10

30

40

50

2.0

2.5

3.0

5

10

15

按正交表中各因素的比例各取HP-β-CD4.0g于超声清洗器中加蒸馏水溶解，待溶解完全后放入磁力搅拌器中，固定转速，缓慢滴加挥发油0.5ml（分散于0.5ml乙醇中），在不同温度下继续搅拌至规定时间，抽滤，以少量蒸馏水洗涤，再以少量无水乙醇洗涤至无挥发油气味，-60℃真空冷冻干燥至恒重，得HP-β-CD包合物。

直观分析结果：

确定最佳包合工艺条件为A3B1C2D1，即油：

HP-β-CD为1：

10，温度30℃，搅拌2.5h，HP-β-CD浓度5%。

表2HP-β-CD包合百里香挥发油工艺L9（34）正交试验结果

Tab.2ResultsoforthogonaltestoninclusionofvolatileoilwithHP-β-CD

实验号

因素水平

包合物得率（%）

油利用率（%）

综合评分

A

B

C

D

1

1

1

1

1

92.33

61.00

70.399

2

1

2

2

2

90.38

52.49

63.857

3

1

3

3

3

88.08

58.47

67.353

4

2

1

2

3

92.46

84.19

86.671

5

2

2

3

1

91.74

49.18

61.948

6

2

3

1

2

90.88

73.02

78.378

7

3

1

3

2

95.50

68.95

76.915

8

3

2

1

3

95.68

58.92

69.948

9

3

3

2

1

95.94

81.87

86.091

K1

201.6090

233.9850

218.7250

218.4380

K3

226.9970

195.7530

236.6190

219.1500

K3

232.9540

231.8220

206.2160

223.9720

R

31.3450

38.2320

30.4030

5.5340

实验采用包合物得率和油利用率作为评价指标，其权重系数分别为0.3，0.7

表3HP-β-CD包合百里香挥发油工艺L9（34）正交试验结果方差分析表

Tab.3VarianceanalysisoforthogonaltestoninclusionofvolatileoilwithHP-β-CD

方差来源

离差平方和

自由度

方差

F值

显著性P

A

184.7273

2

92.3636

30.5706

<0.05

<0.05

<0.05

>0.05

B

307.4819

2

153.7410

50.8853

C

155.6681

2

77.8340

25.7616

D

6.0426

2

3.0213

1.0000

按最佳包合工艺条件为A3B1C2D1，即油:

羟丙基-β-环糊精为1:

10，温度30℃，搅拌2.5h，HP-β-CD浓度5%进行验证实验，得到三组实验数据（见表4）结果平均包合物收率为88.76％，平均油利用率为89.63％，高于正交表中实验条件下结果。

表4验证实验数据

Tab.4Verifytheexperimentaldata

验证实验

一

二

三

平均数据

包合物收得率（%）

91.40

90.72

93.18

91.77

油利用率（%）

83.22

77.75

84.85

81.94

通过正交实验筛选混合油的最佳包合工艺，挥发油与HP-β-CD比例为1:

10，包合时间为2.5h，包合温度为30℃，HP-β-CD浓度5%。

验证试验结果表明本工艺重复性较好，质量稳定，包合物收得率和油包合率均较高。

挥发油经羟丙基-β-环糊精包合后，其稳定性好，便于制剂，减少了药物的损失量，且包合物有效掩盖了挥发油性气味，保持挥发油生理活性，因而大大提高了制剂产品的质量。

3.5包合物质量考察

3.5.1紫外光谱法

取20μl百里香挥发油溶于20ml乙醇作供试品；取20μl包合物提取的百里香挥发油溶于20ml乙醇作供试品；262mg挥发油包合物溶于20ml乙醇作供试品;取20μl挥发油240mgHP-β-CD物理混合溶于20ml乙醇作供试品;取240mgHP-β-CD溶于20ml乙醇作供试品，在190～400nm范围内进行扫描，各供试品紫外光谱图见图1。

图1百里香挥发油、环糊精、提取包合物中挥发油、物理混合物与包合物的紫外光谱图

Fig.1Thymevolatileoil,HP-β-CD,extractionoftheinclusioncompoundinthevolatileoil,theUVspectrumofphysicalmixtureandinclusioncomplexes

3.5.2红外光谱法

取百里香挥发油、包合物提取的百里香挥发油、挥发油包合物、挥发油-HP-β-CD物理混合物、HP-β-CD各少量作为试样1、2、3、4、5。

各样品用溴化钾压片后在400～4000cm-1叫范围内进行扫描，各供试品红外光谱图见图2。

百里香分子结构中有酚羟基体系，在范围1200～1300cm-1内有吸收，可作为鉴定包合效果的依据。

物理混合物的红外光谱图在3400～3500cm-1及1200～1300cm-1范围内所出现的特征峰在HP-β-CD和挥发油的图谱中均可找到，说明HP-β-CD与挥发油并未发生作用；包合物图谱在2932.91cm-1处的峰型减弱并且发生偏移，在1253.5cm-1处的羟基特征峰消失，推测挥发油被包合，HP-β-CD对挥发油的羟基产生了屏蔽效应。

图2百里香挥发油、环糊精、提取包合物中挥发油、物理混合物与包合物的红外光谱图

Fig.2Thymevolatileoil,cyclodextrininclusioncompoundextractvolatileoil,physicalmixtureandinclusioncomplexesinfraredspectra

3.6百里香挥发油原油与包合物中提取油的化学成分的分析比较[13-20]

3.6.1气相色谱－质谱分析条件

气相色谱条件：

色谱柱：

5%苯甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（弱极性柱）TR-5MS，30m×0.25mm，膜厚0.25μm；柱温：

250℃；进样口温度：

250℃；程序升温：

从50℃开始，保持3min，以8℃/min的升温速率升至250℃，并保持2min；载气：

高纯氦气；载气流速：

1.0ml/min；载气模式：

恒流模式；进样方式：

分流进样；分流比1∶20。

质谱条件：

传输线温度：

270℃；电离方式:

EI；电子能量:

70eV；离子源温度250℃；质量扫描方式：

FullScan；质量扫描范围:

50-650；溶剂延迟:

2min；质谱数据库：

NlST2005版标准质谱检索库。

3.6.2百里香精油的分析

在上述仪器条件下，取用乙醚稀释的百里香挥发油0.2μL进样进行分离，得总离子流图，用面积归一化法测定各组分的百分含量并用气相色谱-质谱联用技术做挥发油的GC-MS总离子流色谱检测，所得质谱图经NIST05版计算机质谱数据库检索，以确定百里香精油的化学成分。

3.6.3结果与讨论

本实验通过GC-MS联用分析了百里香精油原油与包合物中提取油的化学成分,经气相色谱处理机用面积归一化法从其总离子流图（图3、图4）中计算了各组分的百分含量,并用气相色谱-质谱联用技术做GC-MS离子流色谱检测，所得质谱图经计算机质谱数据库检索,确定了百里香精油的绝大部分化学成分，分析鉴定结果见表5、表6。

3.6.3.1百里香挥发油化学成分的分析鉴定

图3百里香挥发油的GC-MS总离子流色谱图

Fig.3TotalionchromatogramofessentialoilfromThymusmongolicusbyGC/MS

表5百里香挥发油原油化学成分气-质联用分析结果

序号

保留时间

/min

化合物名称

化学式

分子量

相对含量

/%

1

9.33

1-甲基-2-异丙基-苯

Benzene,1-methyl-2-（1-methylethyl）

C10H14

134

18.62

2

9.48

顺式-1-甲基-4-异丙基-2-环己烯-1-醇

2-Cyclohexen-1-ol,1-methyl-4-（1-methylethyl）-,cis

C10H18O

154

4.47

3

10.00

1-甲基-4-异丙基-1,4-环己二烯-1-醇

1,4-Cyclohexadiene,1-methyl-4-（1-methylethyl）-

C10H16

136

1.76

4

10.22

2-甲基-5-（1-异丙基）二环[3.1.0]己烷-2-醇

Bicyclo[3.1.0]hexan-2-ol,2-methyl-5-（1-methylenthyl）-,（1.alpha,2.beta,5.alpha.）-

C10H18O

154

1.09

5

12.25

茨醇Borneol

C10H18O

154

3.12

6

12.42

2-甲基-5-异丙基-二环[3.1.0]己烷-2-醇Bicyclo[3.1.0]hexan-2-ol,2-methyl-5-（1-methylethyl）-,（1à,2à,5à）-

C10H18O

154

1.05

7

13.58

2-甲氧基-5-甲基-异丙苯Benzene,1-methoxy-4-methyl-2-（1-methylethyl）-

C11H16O

164

11.08

8

14.55

百里香酚

Phenol,2-methyl-5-（1-methylethyl）-

C10H14O

150

45.13

9

16.68

石竹烯Caryophyllene

C15H24

204

1.12

10

19.26

2,5-二叔丁基对甲酚

Caryophylleneoxide

C15H24O

220

2.34

由表1可知,百里香挥发油原油中含量在2%以上的成分有；1-甲基-2-异丙基-苯（18.62%）、顺式-1-甲基-4-异丙基-2-环己烯-1-醇（4.47%）、茨醇（3.12%）、2-甲氧基-5-甲基-异丙苯（11.08%）、百里酚（45.13%）、2,5-二叔丁基对甲酚（2.34%）。

其中,具有药用价值的成分有：

莰醇，是多中天然挥发油的成分，用于合成香料、农药、樟脑等。

百里酚，有特殊香气，是多种香精油的组分之一，对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，有防腐和杀菌作用，是指被药物、香料和指示剂的原料。

石竹烯，具有特异气味，用作香料，有平喘、镇咳、祛痰作用，临床上用于治疗气管炎。

3.6.3.2百里香挥发油提取油化学成分的分析鉴定

图4包合物中提取油的GC-MS总离子流色谱图

Thyme volatileoil extracted inclusioncompound

TotalionchromatogramofessentialoilfromThyme volatileoil extracted inclusioncompoundbyGC/MS

表6包合物中提取油化学成分气-质联用分析结果

序号

保留时间

/min

化合物名称

化学式

分子量

相对含量/%

1

9.37

四甲基苯

Benzene,1,2,4,5-tetramethyl-

C10H14

134

19.93

2

9.51

桉叶醇

Eucalyptol

C10H18O

154

4.75

3

10.02

1-甲基-4-（1-甲基乙基）环己醇

1,4-Cyclohexadiene,1-methyl-4-（1-methylethyl）-

C10H16

136

2.01

4

10.24

2-甲基-5-（1-异丙基）二环[3.1.0]己烷-2-醇

Bicyclo[3.1.0]hexan-2-ol,2-methyl-5-（1-methylethyl）-,（1à,2à,5à）-

C10H18O

154

1.14

5

12.29

à-Santolinealcohol

C10H18O

154

3.22

6

12.44

2-甲基-5-异丙基-二环[3.1.0]己烷-2-醇）

Bicyclo[3.1.0]hexan-2-ol,2-methyl-5-（1-methylethyl）-,（1à,2à,5à）-

C10H18O

154

1.07

7

13.60

2-甲氧基-4-甲基-1-（1-甲基乙基）苯

Benzene,2-methoxy-4-methyl-1-（1-methylethyl）-

C11H16O

164

10.90

8

14.56

百里香酚

Phenol,2-methyl-5-（1-methylethyl）-

C10H14O

150

42.78

9

16.69

石竹烯

Caryophyllene

C15H24

204

1.17

10

17.97

香木兰烯

1H-Cycloprop[e]azulene,decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-,[1aR-（1aà,4aá,7à,7aá,7bà）]-

C15H24

204

2.12

11

19.27

Ledeneoxide-（II）

C15H24O

220

2.39