组织培养实验植物部分.docx

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组织培养实验植物部分

组织细胞培养技术实验教案

实验一植物组织培养的培养基的配制、灭菌与仪器操作培训

实验二植物的离体培养

实验三植物离体培养中的形态观察和愈伤组织继代培养

实验四动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训

实验五鸡胚原代细胞的培养

实验六动物细胞的传代培养

实验七动物细胞的冻存与复苏实验一植物组织培养的培养基的配制、灭菌与仪器操作培训

【目的要求】

学习并掌握植物组织常用培养基的组成、配制与灭菌方法。

培养基能够提供植物生长、繁殖所必须的各类营养物质，以及生长因子，是开展植物组织培养研究的基础和前提。

植物的种类不同，研究的目的不同，所需要的培养基的种类也各不相同。

【实验用品】

1.实验用具：

电子天平、烧杯、量筒、三角瓶或培养瓶、移液管、药匙、玻棒、pH试纸、吸耳球、牛皮纸、皮筋等。

2.药品：

蔗糖、琼脂、0.1mol/LNaOH、0.1mol/LHCL、各种培养基母液、激素母液

【内容与方法】

1.分组配制培养基激素

用分析天平称取生长素或细胞分裂素50-100mg。

生长素用少量95%的酒精或0.1mol/L的NaOH溶解，细胞分裂素用0.1mol/LHCL加热溶解。

加蒸馏水定容至100ml配制成0.5-1mg/L的溶液。

∨激素﹦∨配制×培养基中所要求的激素浓度÷激素母液浓度

2.湿热灭菌培养基

称取规定数量的琼脂，加水到培养基最终容积的3/4，水浴或电炉使之加热溶解。

根据配方要求，把按顺序量取的各种母液以及称取的蔗糖，都加入煮好的琼脂中，然后加水定容。

用0.1mol/L的NaOH或者HCl调pH。

分装培养基，包好或盖好，标明编号。

121℃（103kPa）灭菌15-20min。

3.作好植物组织培养的各项准备工作

制备无菌水：

121℃（103kPa）灭菌40min；配制0.1%HgCl2溶液（放置棕色瓶中）；准备接种用培养皿、金属器械等用具。

注意：

1.实验前1天，无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。

然后紫外线消毒。

2.实验中所用的各种容器一定要洗净、烘干。

3.用电子天平称量药品时，一定要用称量纸，对于有腐蚀性的药品，应将其放置在小烧杯中称量。

4.各种母液应保存在2-4℃的冰箱中，以免变质、长霉。

5.使用高压灭菌锅时，一定要正确操作，并提前检查其中的水是否合适。

6.HgCl2属于一种腐蚀性极强的剧毒物品，配制时要注意安全。

实验二植物的离体培养（两次课程）

【目的要求】

1：

尝试进行植物的组织培养

2：

了解植物组织培养的基本原理

【实验用品】

   材料：

百合鳞茎、菊花，灭菌培养基，体积分数为70%的酒精，体积分数为20%的次氯酸钠溶液，无菌水。

   用具：

锥形瓶或大试管，烧杯，酒精灯，恒温箱，接种箱，滤纸，消毒用酒精棉球，培养皿，解剖刀，镊子、打孔器。

【内容与方法】

1.外植体消毒：

在接种箱上将胡萝卜段用酒精消毒并用无菌水清洗，再用次氯酸钠处理，立即用无菌水消毒。

用无菌滤纸吸去外植体表面的水分，用无菌解剖刀锲成横切片，再选取有生命力旺盛的部位，切成小块。

2.接种：

将组织块接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。

3.培养：

将接种后的组织块，放在23～26℃恒温避光条件下培养，一周后，检查培养材料的污染情况；14天后，观察愈伤组织的生长状况。

实验三植物离体培养中的形态观察和愈伤组织继代培养

【目的要求】

诱导愈伤组织是细胞培养的基础，愈伤组织经过不断继代培养才能变得疏松，易于分散，有利于建立良好的悬浮系。

【实验用品】

   材料：

外植体组织。

   用具：

锥形瓶或大试管，烧杯，酒精灯，恒温箱，接种箱，滤纸，消毒用酒精棉球，培养皿，解剖刀，镊子、打孔器。

【内容与方法】

1.设计不同激素比例的继代培养基。

2.选择待培养物伤口周围长出的淡黄色、疏松、生长良好的愈伤组织转移至新培养基中继代。

3.培养：

将接种后的组织块，放在23～26℃恒温避光条件下培养，一周后，观察愈伤组织的生长状况。

实验四动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训

一、实验目的

1、掌握动物细胞培养相关设备、器材的使用方法。

2、掌握各类器皿、工具的清洗、包装、灭菌方法

3、掌握各类培养基及试剂溶液的配制、灭菌方法

二、实验原理

离体条件下的细胞对任何有害物质均十分敏感，极少的残留物都可能对细胞产生毒副作用，因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，以达到不含任何残留物的要求。

而玻璃、橡胶、塑料、布类、纸类等不同类型的材料应采用不同的清洗和消毒、灭菌方法。

细胞培养失败的一个常见原因是微生物污染，有时是操作过中不规范造成的，有时则是相关用品本身有污染造成的，因此在培养细胞前各种用品均需要进行严格消毒或灭菌。

培养液是进行细胞体外培养最基本、最主要的条件之一，掌握常见培养液的成分、性质与配制方法是细胞培养操作者应具有的基本知识和能力。

三、实验内容

1、设备

（1）CO2培养箱

CO2培养箱要提前消毒，有些自己带有高温干热灭菌功能，大部分则宜用“纯水擦洗――95%酒精擦洗——紫外照射杀菌”的消毒方法。

初次开启仪器时要提前一天矫正CO2的浓度值。

然后设定好温度等参数。

关于钢瓶的压力阀门控制：

钢瓶上的阀门松紧程度不是十分重要，关键靠供气阀门控制压力在0.1（越拧紧压力越高，所以可先把供气阀门打到松弛状态，然后再开钢瓶阀门）

（2）倒置显微镜

打开电源开关，确保光路杆调至“观察”状态，选择所需放大倍数的物镜，调节至适当亮度。

将培养瓶放在载物台上，转动粗微调调节。

如需拍照，则在电脑中打开软件，并将光路杆调至“拍照”状态。

注意不要随便误打开荧光灯，以免浪费其寿命。

一旦打开荧光光源后，至少要15分钟后才能关闭，关闭后至少要5分钟才能再次开启。

（3）其他：

高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。

2、器具

（1）玻璃类

细胞培养瓶（有的是塑料的）、吸管、三角烧瓶、玻璃平皿、普通玻璃瓶

方法：

玻璃类一般是清水浸泡、洗衣粉液刷洗、浸酸过夜、自来水冲洗、然后依次用去离子水、一蒸水、三蒸水分别润洗5～6次。

然后烘干、包扎、灭菌。

（2）塑料类

细胞培养瓶、细胞培养板等

方法：

一般是一次性用品，拆包后直接使用；如果要重复使用则参照玻璃器皿的方法，最后照射紫外线消毒。

（3）金属类

剪刀、镊子、灭菌筒等

方法：

清洗后用纸包扎，高压灭菌。

（3）其他

纱布、脱脂棉、酒精棉、棉绳、牛皮纸、铝箔、一次性手套、乳胶手套等

方法：

主要是用于包扎灭菌上述器具等，一般不存在自身如何灭菌的问题。

3、试剂

（1）基础培养液（如1640、MEM、DMEM、199等）

干粉溶于约800ml超纯水（三蒸水），袋子内面也冲洗收集进去，搅拌助溶（不宜加热）

按说明书，再补加NaHCO3（2g）、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。

用1MHCl或1MNaOH调PH至7.1

定容至1L，过滤除菌（蔡氏滤器抽滤）

（2）完全培养基

基础培养基临用前加入小牛血清（10%－20%）。

（注：

新买血清要先56℃灭能半小时，以杀灭其中的补体物质，消除对细胞的毒性。

然后分装，－70℃～－20℃低温冻存）

加抗生素，双抗终浓度一般为青霉素100U/ml、链霉素100U/ml。

（传统市售青霉素80万U/瓶，可溶于4ml体积；市售链霉素为100万U/瓶，可溶于5ml体积；用时每L培养液各加0.5ml。

另：

青霉素钠1670U/mg,链霉素碱1000U／mg,硫酸链霉素798U／mg）

（3）0.25%胰蛋白酶

称取250mg胰蛋白酶干粉于无菌烧杯中，先用灭菌的D－Hanks（即不含Ca2+、Mg2+和葡萄糖）液调成糊状，然后补足至100ml，搅拌混匀，在磁力搅拌器搅拌至溶解（室温和4℃交替进行）

过滤除菌，分装入青霉素小瓶，低温冻存。

使用前可用无菌7.4%NaHCO3调PH至7.2左右。

（4）洗涤液、平衡盐溶液（Hanks、D-Hanks等）

Hanks液成分:

Na2HP04H200.06g/L

KH2P040.06g/L

MgSO47H200.20g/L

葡萄糖1.00g/L

NaCl8.00g/L

CaCl20.14g/L

①先单独溶解CaCl2于100ml超纯水（或三蒸水）；

②再单独溶解MgSO47H20于100ml超纯水；

③再单独溶解其他成分于650ml超纯水（按表中顺序,每次待前一成分充分溶解再加下一种成分）；

④将①液和②液缓慢倒入③液中，并不时搅动，防止沉淀。

⑤将0.35gNaHCO3溶解于37℃100ml超纯水

⑥用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红

⑦将⑤、⑥液逐滴并搅拌加入④液

⑧将⑦液移入容量瓶，定容至1L，混匀。

⑨高压灭菌（8磅10min），4℃保存。

四、总结与讨论

1、写出自己所在的小组准备出的全部用品，并说明其处理方法。

2、写出实验室的CO2培养箱和倒置显微镜的型号和操作要领。

3、Hanks液的配制中，为什么钙盐和镁盐需单独溶解？

4、胰酶消化液为什么最好用不含Ca2+、Mg2+的BBS配制？

实验五鸡胚原代细胞的培养

一、实验目的

1、掌握鸡胚组织的取材、剪切、消化技术

2、掌握细胞计数技术

3、掌握原代动物细胞制备过程

4、为细胞传代、冻存等后续实验操作提供材料

二、实验原理

发育中的鸡胚含有大量处于活跃分裂和生长过程的细胞，尤其是其中大量的成纤维细胞，是进行细胞培养良好的取材来源。

动物组织用中均含有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰蛋白酶消化法能去除间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞则容易生长。

三、实验用品

1、器材

超净台（或生物安全柜）、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养瓶、小玻璃瓶（青霉素小瓶）、不锈钢灭菌筒、100目不锈钢网筛（1个）、灭菌吸管、解剖剪（中号1把；小型眼科剪1把）、镊子（中号镊子2把，弯头眼科镊1把）、吸耳球、计数板、手动计数器、酒精棉、灭菌的平皿（3个）、无菌离心管（10ml规格，2只）。

2、试剂

Hanks液（或D-Hanks液）、DMEM（须含10-20%血清）、0.25%胰蛋白酶

3、材料

9-12日龄鸡胚（即鸡胚预先在培养箱中37℃培养9-12日，大头朝上，每天翻蛋至少2次，用水盘保证湿度）

四、实验步骤

（需提前准备：

鸡胚提前9天孵化、开启CO2培养箱、器材用品包扎灭菌并烘干、培养液从冰箱中取出并融化、超净台提前开紫外灯半个小时进行消毒、37℃恒温水浴准备好）

1、取材

取9-12d的鸡胚2个，放入超净台中，大头（气室）朝上放置于蛋托上，酒精棉消毒气室部位。

用镊子敲破和剥去气室部位外壳，换一把镊子挑破尿囊膜和羊膜，再换一把镊子小心取出鸡胚，放于无菌平皿中。

用小剪刀和小镊子配合，去除头和内脏，用Hanks液清洗2-3次，用吸管洗弃清洗液，以洗去红细胞。

2、剪碎

将胚体移入另一无菌平皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成小块，然后移入无菌青霉素小瓶中，在小瓶内用眼科剪反复剪成1mm3的小块。

3、消化

加入适量0.25%胰蛋白酶液（一般每10个鸡胚加20ml消化液），盖好橡皮塞，置37℃恒温水浴中消化20-30min，每隔5min摇动1次，使组织块散开。

视组织块变得疏松、颜色略变白时，从水浴中取出。

4、终止

在超净台中，用吸管轻轻吸弃消化液，加入2-3ml含小牛血清的培养液，以终止消化。

然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成单细胞状态，静置片刻，使未能消化的大块组织自然下沉，然后将上层液通过100目不锈钢网筛，制备细胞悬液。

转移入无菌离心管。

5、稀释、接种

离心（1000rpm，10min），弃上清，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打混匀。

取少量样品计数，根据结果再对拟培养的细胞稀释到浓度为1X106个/ml。

将稀释好的细胞悬液接种培养瓶，培养液的量以充分覆盖瓶底为度。

6、培养

将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。

培养时，培养瓶的盖子不要拧得太紧，以不会往下掉为度，以便CO2进入。

细胞贴壁后延展成长梭形，培养7－10d后即可长成致密单层细胞。

五、结果与讨论

在倒置显微镜上观察和记录鸡胚原代细胞的形态，以及培养细胞的贴壁时间、增殖时间和完全汇合的时间，同时拍摄部分代表性的照片。

六、注意事项

1、消化培养法效率高，可得到大量的原代细胞用于培养，但操作步骤较多，操作时要特别注意无菌操作，以防微生物污染而导致培养失败。

2、对于不同的组织需用不同的消化方法，一般而言，胚胎类软组织用胰蛋白酶和EDTA即可得到理想的消化效果，而对于成体组织由于存在大量的细胞外基质，需用胶原酶，有时配合使用透明质酸酶会加速消化过程。

3、在组织消化过程中，为了防止消化过度影响细胞细胞的贴壁生长，要随时取样进行观察，发现组织已分散成细胞团或单个细胞时应立即终止消化。

4、细胞接种浓度不宜过大，否则会影响细胞贴壁和细胞生长。

5、培养后要随时观察细胞的生长状态和培养液的变化，以便发现异常情况后及时对症处理。

附：

细胞计数简要步骤

1、计数板

整个计数室分成9个大方格，本实验用到四角的4个大方格，这些大方格又各自分成16个中方格。

（每个大方格容纳体积为“0.1cm×0.1cm×0.01cm＝10－4ml”）

中央大方格的25个中方格，每个还继续分成16小方格，主要用于红细胞计数，本实验不使用。

2、加样：

将盖玻片放在技术板正中。

用毛细管轻轻吹打细胞悬液使其混合均匀后，取少许细胞悬液，在技术板与盖玻片之间加少量细胞悬液，由于毛细作用细胞悬液会充入技术室内。

加样量不要过少或带气泡，也不能溢出盖玻片。

如出现失败，需洗净计数室并干燥后重新操作。

3、计数

细胞培养液滴入计数室后，须静置2－3min，然后在低倍镜下计数。

在显微镜下，用10X物镜观察计数板四角的大方格中的细胞数，为降低误差，应计四个大方格的总和以求平均值。

对于横跨刻度上的细胞，则一般按照“数上不数下，数左不数右”原则。

4、计算

细胞数/每ml体积＝（四个大方格细胞数之和/4）X104

实验六动物细胞的传代培养

一、实验目的

1、掌握细胞培养传代技术

2、掌握判断动物细胞生长状态的要领

3、进一步巩固细胞培养中的无菌操作

二、实验原理

当原代细胞或细胞系增殖到一定密度（一般长成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个培养瓶中扩大培养，此过程为传代培养。

一般所说的细胞代数即是指细胞传代培养的次数。

三、实验用品

1、器材

超净台、倒置显微镜、CO2培养箱、细胞培养瓶、吸管、三角瓶、胶头等。

2、试剂

Hanks液（或D-Hanks液）、消化液（0.25%胰蛋白酶液）、完全DMEM液（含10%胎牛血清FBS+抗生素）

3、材料

汇合的鸡胚成纤维细胞

四、实验步骤

1、清洗

取80%或接近汇合的培养细胞，使培养瓶的细胞面向上，将培养液倒入盛污物的三角瓶内（或用吸管吸出培养液），用约2mlHanks液清洗2－3次。

2、消化

向培养瓶内加入消化液约2ml，室温（或37℃）下消化，消化的时间非常关键，须掌握好。

将培养瓶放于倒置显微镜下或靠肉眼观察，镜下当发现细胞质回缩，细胞与细胞间相互接触松散、间隙增大，细胞变圆或出现蜘蛛网状结构时即为适当时候（约3min）。

肉眼观察则会发现细胞培养瓶的底面出现类似水汽的一层结构，即发雾现象，这是因为细胞与细胞间出现缝隙后，透光性变得不均匀，从而产生水汽样结构。

此时应立即将培养瓶直立并进行下面操作以终止消化。

3、终止

向瓶内加入等量含有小牛血清的培养液以终止消化。

拍打培养瓶，促使已松动的细胞从瓶壁脱落。

然后用吸管将细胞从瓶壁吹打下来。

移入离心管，1000rpm离心10min，弃上清以去除胰蛋白酶。

4、重新悬浮

离心完毕后，重新加入培养液约5ml，混匀，吹打勿用力过猛，以免伤害细胞。

5、接种

按照“1瓶传3瓶”的一般原则，细胞悬液按1：

3的比例分配，接种到3个培养瓶内，再向各瓶补加培养液到5ml，作标记后进行培养。

此后每3天换液1次，并注意观察细胞传代培养后的形态变化。

五、实验注意事项

初代细胞的首次传代是很重要的，它是建立细胞系的关键时期。

首次传代一般应注意以下几点：

1、细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代。

把握好传代时机，在细胞生长到80%－90%汇合时传代最好，过早传代细胞产量少，过晚传代细胞健康状态不佳。

2、各种细胞对消化的反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜的消化措施。

有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可以从瓶壁上直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落，不易计数，因此，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。

消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长速度一致，实验结果可靠性大。

3、消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。

用胰蛋白酶与EDTA的混合液进行细胞消化时，要用Hanks液充分洗涤细胞以去除EDTA，因为EDTA的残留会影响细胞的贴壁生长。

六、实验结果与讨论

1、肉眼观察细胞消化时培养瓶底部的变化，并与显微镜下细胞的变化相比较，分析出现这种变化的原因。

2、观察传代培养后不同时间细胞形态变化，并与原代培养细胞进行比较。

实验七动物细胞的冻存与复苏

一、实验目的

1、掌握细胞的冻存方法

2、掌握冻存细胞的复苏方法

二、实验原理

细胞在低温冻存时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

但如果在培养液中加入保护剂（如甘油或二甲基亚砜），则可降低冰点，延缓冻结过程，提高膜对水的通透性，能使细胞内水分在冻结前渗出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

复苏时，为了保证细胞外结晶在很短时间内融化，以避免缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶而对细胞造成伤害，因此采用快速融化的方法。

三、实验用品

1、器材

超净台、移液枪（1ml规格）及相应枪头、吸耳球、吸管、离心管，塑料细胞冻存管（或用eppendorf管代替）、低速离心机、－70℃低温冰箱、液氮罐、水浴锅（提前开37℃）。

2、试剂

0.25%胰蛋白酶、细胞冻存液（用含20%牛血清的完全培养液配制的10%二甲基亚砜，或用甘油代替）

3、材料

培养瓶生长的贴壁细胞

四、实验步骤

1、取对数生长期的贴壁细胞（在冻存前一天最好传代或换液1次），倒弃培养液。

2、用胰蛋白酶消化单层生长的细胞。

3、消化好的细胞转入离心管，1000rpm离心10min，弃上清。

4、加入冻存液，重悬细胞。

5、计数并调整细胞冻存液中的细胞密度为5×106个/ml～1×107个/ml。

用吸管轻轻吹打细胞分散均匀，然后分装入无菌冻存管中，每支2ml冻存管加细胞悬液1ml。

6、冻存管做好标记后，放入小袋或冻存管架。

7、依次采用4℃1小时，－20℃1小时，－70℃过夜，然后投入液氮储存。

（课堂内受时间限制，采用－70℃半小时，液氮半小时，仅进行模拟）

8、从液氮罐中取出冻存的细胞，立即投入37℃水浴中，轻摇至完全融化。

9、将冻存管在离心机上1000rpm离心10min。

10、弃上清，用移液枪加少量培养液入冻存管，轻轻吹打，将其移入细胞培养瓶中，坐好标记。

11、放入CO2培养箱进行培养，培养至次日时可换液，以弃去漂浮的死亡细胞，余下的存活细胞大部分可生长繁殖。

一般一支冻存管内的细胞接种1瓶，培养3－5d后方能长好。

五、实验结果与讨论

1、通过计算活细胞数量、细胞贴壁情况、漂浮的死细胞等可以判断冻存效果。

2、根据所学知识判断复苏的细胞生长状态如何。

实验一总结

1，用PPT在理论课讲解2节课（用简并的课件，大规模培养部分没有讲，其他部分能讲完）

然后讲解分组情况，1班分10组，2班分9组，按学号来。

2，每组出1名学生到实验室领取东西，分发好的用具后，自行负责清洗、灭菌、烘干，在实验开始前准备好。

3，但是后来实验结束后没有按组别上交，导致小瓶和瓶塞丢失数个，原因是时间仓促，两个半接连做，没来得及逐组核对。

4，发现由学生自己灭菌还是容易丢失东西

实验二总结

1．实验准备

当天提前1个小时去整理实验室，发现超净台紫外灯损坏很多，只有开房间里的紫外灯整体杀菌，并把每个台子的风机打开。

酒精灯均无，临时问陈虹领。

超净台共有10个，用记号笔标上编号，让学生按组入座。

问陈虹借用细胞计数板10个，普通显微镜10台。

这次实验放在同一个下午做，发现很紧张，预计的1班13:

30-15:

30,但实际发现时间不够，没有来得及计数，应该安排3个小时为宜。

2班抽样计数了2组，发现如果用5mL培养液溶解离心后的细胞（来自2个鸡胚，用3mL胰酶消化了20min）的话，浓度均在11×106左右，参照此经验值，每组将细胞悬液均进一步稀释了8倍。

2．物品消耗

组数：

2个班共19个组

鸡胚：

实得9日龄鸡胚共25枚（一开始共买了80只，孵化率较低）

酒精棉：

共消耗掉2瓶都不够（需要准备两瓶乙醇，提前制备好，用时每组用一次性手套装取少许）

蛋托：

把蛋托撕开成小块使用

工具：

每组需要小剪刀1把，小镊子需要1把（现在只有10把，已经又订购10，尚未到货），中镊1把，长吸管4支，胶头1只，带塞青霉素小瓶1只，不锈钢滤网1只（目前不够，只有10只），小三角瓶2只，平皿3对，细胞培养瓶1个，10ML塑料离心管1只，灭菌筒1只（不够，共有13个）。

试剂：

小牛血清1瓶（100mL）、双抗1瓶（10ML）、低糖DMEM1瓶（250mL,略嫌紧张）、胰酶1瓶（100mL）、D-Hanks液2瓶（250mL规格）

其他：

1mL移液枪一只，大枪头一盒

3．观察与拍照

第5天时观察，观察需要安排1.5个小时为宜。

显微镜上安装的拍照摄像头无法拍照，PS中不能导入，怀疑是驱动程序损坏，但是用320万像素的手机拍摄效果非常理想。

由张益森、徐海洁同学专门负责拍照后发给其他同学。

实验三总结

1．时间安排

两个班分开做的，1班由于原代培养时未计数，直接悬浮于5mL培养液，导致浓度过大，细胞老化严重。

所以未等到7天，第5天时即进行传代。

本实验堂内耗时1.5小时。

1班周一做的，2班周三做的，周六一起拍照，由张益森和徐海洁负责用手机拍照的，相机反而拍不出来，要对准亮光点，逐渐靠近待亮光区变大变暗，会显示出视野。

从结果看，1班由于接种浓度较高，长出比较多的细胞，2班参差不齐，普遍细胞稀少，也可能跟时间有关。

1班有1个组、2班有2个组（1组和3组？

）均出现了霉菌污染。

2.提前灭菌

吸管（4支每组，用报纸包扎灭菌）、EP管子（作离心管用，饭盒灭菌；也可用10ml离心管）、大枪头。

提前1小时开始照射超净台的紫外灯

准备好酒精棉

3．稀释比例

传代时，1/2的细胞（2支离心管丢弃1支，取1支重悬）重悬于1ml培养液，然后再取其中0.5ml，稀释到5mL,培养。

相当于1瓶传4瓶的比例。

4．一些改动

2ml消化液，消化3min（手持消化），然后加1ml含血清的培养液终止消化。

所有加试液的过程均是由我用枪加，让学生把细胞培养瓶拿过来。

5．注意

超净台编号、新培养瓶编号、EP管子编号。