血清肌酐测量不确定度对肾小球滤过率估算值具有影响徐国宾.docx

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血清肌酐测量不确定度对肾小球滤过率估算值具有影响徐国宾

肌酐测定的标准化与估算肾小球滤过率

徐国宾

北京大学第一医院检验科

徐国宾，1984年毕业于上海第一医学院，获学士学位，1996年于北京医科大学研究生院在职攻读硕士学位。

现任北京大学第一医院检验科研究员，博士生导师，从事临床化学与检验医学教育与研究25年，主要关注临床检验分析和诊断性能评价。

现任中华医学会检验分会委员，北京医学会检验学会常务委员，北京医师协会检验与病理专家委员会委员，全国临床医学计量技术委员会委员，全国卫生专业技术资格考评专家委员会临床检验组成员，北京大学医学部医疗质量管理委员会专家组和研究生教育与管理工作组成员，中华检验医学杂志、中国实验诊断学杂志、临床检验杂志编辑委员会委员，“医学参考报检验频道”副主编兼生化检验与临床专业委员会主任委员。

参与国家自然基金2项、科技部基础平台建设项目1项、“十一五”支撑计划重点项目1项，任“863”重大项目“生物医学关键试剂—临床检验参考品研制”课题组副组长。

国内外发表论文百余篇，其中SCI收录11篇。

参与多部统编教材编写和大型译著的翻译。

曾获2000年度北京市科技进步三等奖1项，排名第四。

慢性肾脏病（CKD）在全球范围的发病率和患病率呈迅速增长的趋势,其主要与人们生活水平和生活方式改变相关的糖尿病、高血压发病率上升有关。

2002年美国肾脏病年报，在美国早期CKD患者有1900万，其中估算肾小球滤过率eGFR<60ml/min者为800万，eGFR>60ml/min，尿微量白蛋白排泄率正常（>30mg/gCr）有1100万。

美国1988到2006年的调查同样显示，替代治疗和终末肾的发生率逐年增加（见图1）。

图12008美国血液透析和移植替代治疗和终末肾数目变化报告

北京大学第一医院王海燕教授牵头进行的流行病学调查研究发现20岁以上中国城市居民成人CKD患病率达9-10%，与发达国家类似，但我们国家人口多，发病的绝对人数多，所以CKD更是中国面临的公共健康问题。

CKD患者在出现明显的临床症状之前，存在较长的无症状阶段，不通过筛查，很难发现相对早期的CKD患者。

国外的研究发现在确诊CKD的患者中，有58.7%至89.7%是由筛查发现的，证明在人群中进行CKD筛查的必要性和有效性。

而CKD的早期诊断，早期治疗可以延缓肾脏功能的减退，提高患者生活质量和延长患者寿命。

实验室检查在CKD早期筛查中具有重要作用。

2006年临床化学杂志发表了由大学、疾病预防控制中心、标准物质研究部门、糖尿病消化道疾病和肾脏病研究院以及诊断企业联合成立的美国肾脏病教育计划检验工作组有关人血清肌酐测量质量改进建议。

本文将论述对中国人血清肌酐测定实验室间的变异及其对估算肾小球滤过率（eGFR）应用的影响并适当介绍以及人血清肌酐测定标准化研究的有关进展。

一、人血清肌酐及eGFR在CKD诊断中的作用

1999年美国肾脏病基金会（NKF）公布的K-DOQI（KidneyDiseaseOutcomeQualityInitiative）指南提出了新的CKD定义，确定CKD的诊断应基于肾小球滤过率（GFR）和/或肾损伤的证据（见表1）。

CKD的诊断标准为：

（1）肾脏损伤（肾脏结构或功能异常）≥3个月，可以有或无GFR下降，可表现为以下任何一条：

病理学检查异常；

肾损伤的指标：

包括血、尿成分异常或影像学检查异常；

（2）GFR＜60ml/min/1.73m2≥3个月，有或无肾脏损伤证据。

根据肾小球滤过率，K-DOQI指南将CKD分为五期。

期，GFR≥90，伴有其他慢性肾损伤证据；

期，GFR60～89，伴有其他慢性肾损伤证据；

期，GFR30～59；

期，中度异常；GFR15～29；

期，已确定有肾功能衰竭；GFR<15或正在接受透析。

不同分期CKD患者的症状及各种合并症的发生率不同，分期对于临床处治具有一定指导价值。

表1美国肾脏病基金会K-DOQI指南中CKD定义

GFR测定的金标准为菊粉、碘海群（iohexol）或核素标记的DTPA清除率。

这些方法复杂,操作难度大，一般仅限于研究作为建立eGFR估算方程比较对象。

虽然血清肌酐（SCr）水平受到年龄、性别、种族、肌肉量、饮食的影响，苦味酸动力学法测定方法还受黄疸、乳糜、溶血和某些药物的干扰。

但由于肌酐血清水平相对恒定，不被肾小管重吸收，排泌量较少，测定廉价，是临床上应用最为广泛的评价GFR的试验。

肌酐清除率（Ccr）较Scr更灵敏/特异的反映GFR下降的指标，但必须准确留取4小时、8小时或24小时尿液，病人，特别是门诊患者依从性差，也不适合于流行病调查。

血清CystatinC是近几年被评价较多的反映GFR的指标，大量临床实践表明，血清CystatinC诊断GFR下降较血清肌酐的特异性和敏感度要高，与CCr相比较也稍有优势。

其测定采用的是颗粒增强免疫比浊法，测定成本目前还较高。

因为测定价格、适用于生化分析仪的高通量检测方法刚刚问世不久以及主要基于CystatinC估算的GFR方程发表不长时间尚需进一步验证等诸多因素，因此尚未见到有关以CystatinC为诊断指标的CKD患病率的流行病学研究的资料。

对于血清肌酐测定，大家已有共识：

只有当GFR下降50%时才开始升高。

　我们以99mTc-DTPA清除率测得的肾小球滤过率（GFR）作为诊断评价的金指标，用受试者工作特征曲线（ROC）观察到肌酐最佳诊断界值为107µmol/L，与参考区间上限的99%分位值（男性110µmol/L，女性93µmol/L）接近，其诊断肾小球滤过功能受损的的灵敏度、特异性分别为和74.6%、90%。

如果诊断界值移到133µmol/L，灵敏度会提高，但灵敏度则下降到50%。

建议以99%双侧作为血清肌酐的参考区间，但必须清楚诊断界点的诊断效能。

1999年，LeveyAS等利用了1628例CKD病人的资料，以碘酞酸盐清除率作为金标准，考虑了病人年龄、性别、血清肌酐（Scr）、尿素、白蛋白等因素，进行数学运算和方程模拟，开发了一系列GFR的评估方程，用来估算GFR，其中方程7因其结果相对准确而被广泛采用。

2000年，作者又将方程7进行简化，得出主要基于血清肌酐的简化的“四变量”（年龄，性别，种族以及血清肌酐）MDRD计算方程，该计算方程仅需测量Scr，结合病人的年龄性别，即可推断出GFR。

该方程中肌酐的单位为mg/dl。

GFR[ml•mim-1•（1.73m2）-1]=186×（SCr）-1.154×（age）-0.203×（0.742女性）×（1.210非裔）

研究表明，MDRD方程的开发对象是CKD患者，适用于评估西方CKD人群GFR，其准确性和方便性均优于肌酐清除率（Ccr）,对于糖尿病和非糖尿病患者的应用诊断效能类似。

MDRD的应用应该注意：

①对于健康人或GFR≥90mL·min-1的CKD患者，此研究公式的性能不明。

此研究公式应用于儿童，75岁以上的老年人，孕妇，有严重并发症的患者或体型极端，肌肉量大或营养不良的人可能会产生估算GFR的误差。

但不推荐应用于健康个体或所有住院患者肾功能的评价。

②估算儿童GFR多采用Schwartz和Filler方程，因为考虑了GFR和身高/血肌酐之间的比例关系。

Schwartz公式：

GFR=k身高（cm）/血肌酐（μmol/L），k为常数（0~18个月正常婴儿k为40，2~16岁女孩及2~13岁男孩k均为49，13~16岁男孩k为62）。

Filler公式（ShouldtheSchwartzformulaforestimationofGFRbereplacedbycystatinCformula?

PediatrNephrol,2003,18:

981–985）：

logGFR=1.962+[1.123log（1/CysC）]。

2009年Schwartz又发布基于Scr、cystatinC、BUN的方程：

GFR[ml/（min·1.73m2）]=39.1[Height（m）/Scr（mg/dl）]0.516×[1.8/cystatinC（mg/L）]0.294[30/BUN（mg/dl）]0.169[1.099]male[Height（m）/1.4]0.188（JAmSocNephrol.2009Mar;20（3）:

629-37）。

这些方程正被广泛应用于西方儿童的GFR评估。

而是否适于中国儿童慢性肾脏病患者尚未得到验证。

③由于肌酐测定的方法不同，实验室间结果差异对eGFR值影响大。

有关影响在后面还会有论述。

④K-DOQI指南建议当eGFR大于60ml/min,实验室只需报告“eGFR>60/min”,而当eGFR<60ml/min时，则报告具体的数据。

eGFR<60ml/min是CKD诊断阈值（threshold），这是因为此时的肾功能下降大约50%，此时病人可能伴有数个并发症。

国际上有很多对MDRD方程的评价、改良和验证（谌贻璞.正确应用肾小球滤过功能检验十分重要.中华检验医学杂志,2007,30（4）:

374-276），国内也作了相关的研究，对于各个方程在各期慢性肾脏病中应用研究正在进行当中。

我们的研究结果发现，以简化的MDRD方程作为模型计算CKD患者eGFR，当其小于29ml/min时，SCr,CCr和CystatinC三者异常率为100%，在39-59ml/min之间时，三者为84%、91%和98%，在60-89ml/min之间时，三者则为6.8%、70%和86%。

在这项普通的研究中，虽然没有进行GFR金指标的检测，但结果提示：

①与其他两项具较好诊断特异性和敏感度的常规指标CCr、CystatinC比较，eGFR<60ml/min时符合率很高，进一步说明<60ml/min作为CKD的诊断阈值具有较好的特异性；②eGFR在39-59ml/min之间患者的SCr阳性率为84%，SCr可能有16%的假阴性，说明SCr不应该单独应用。

③eGFR在60-89ml/min，甚至大于在大于90ml/min的CKD患者组中，仍有相当高比例的CCr和CystatinC异常。

进一步说明,综合分析病人病史、治疗史和危险因素，联合检测SCr,eGFR,CCr和CystatinC,，对于高危患者进行动态监测，将有助CKD的早期诊断。

MDRD方程是1999年开发的。

MDRD方程中的血清肌酐测定量值溯源到HPLC-UV方法。

HPLC-UV测定的特异性和重复性均不理想。

新千年初液相质谱和气相质谱被提名为血清肌酐测定的参考方法，2007年还是Levey发布肌酐测定量值溯源质谱的新的MDRD方程，他们称再表达MDRD（re-expressedMDRDequation）。

GFR[ml•mim-1•（1.73m2）-1]=175×（SCr）-1.154×（age）-0.203×（0.742女性）×（1.210非裔）

其实再表达的MDRD方程和老方程之间就是系数发生改变。

该方程是通过肌酐酶法与苦味酸法之间的相关数学关系转换过来的。

两个方程最大的弱点是高值偏低的问题。

我们以核素标记的DTPA清除率作为金指标也有相关发现，结果见图2。

2009年我们在美国临床化学通报我们报道了该研究结果。

其中Δ为实测GFR,□为采用MDRD方程估算GFR,●为日本发布的基于酶法测定血清肌酐的方程计算结果。

日本方程计算结果更偏低。

图2不同MDRD方程估算的eGFR存在高值偏低的情况

老方程和再表达方程计算结果高值eGFR估算结果偏低，这是因为用于建立模型的患者多为CKD3期。

日本的方程建立时也有同样的问题。

这个问题Levey等早就注意到。

2009年以Levey为首的研究小组再次公布了主要基于肌酐的MDRD新方程，该方程称为MDRD-EPI，方程见表2。

EPI方程的特点是建立模型患者有CKD早期患者，而且方程按照血清肌酐的值进行分层，女性以62，男性以80为界，再按人种肤色又进一步分为白人和黑人两类，一共有4个方程。

在这里应该引起重视的是，肌酐分层的节点。

这个节点与我们初步观察到的中国人血清肌酐第90%和95%分位值非常相似。

这是无独有偶，还是必然真的值得探讨。

但有一点提示我们，血清肌酐在60μmol/L这种低水平时也应该准确测定。

我们初步研究结果显示（资料尚未发表），白人方程是较适合我们中国人的。

表2最新公布的eGFR估算的CKD-EPI方程（肌酐单位μmol/L）

二、血清肌酐测定方法间的偏差及其对eGFR值的影响

影响eGFR估算值估计不确定度（estimateduncertainty）的来源有：

①肾脏滤过功能本身的生物学变异。

肾脏滤过功能受到运动、体位、血压变化、妊娠、血糖控制、细胞外液、急性或慢性肾脏病等的影响。

②血肌酐的生物学变异。

肾脏滤过功能本身的生物学变异可因素影响血循环或尿中各个标志物的浓度水平，包括估算方程中各个参数的浓度。

有研究报告，非CKD患者血清肌酐的生物变异可以达到4.1%-4.3%。

③建立模型所用“金标准”的重复性和方程中各参数测定方法的准确性、重复性和及其抗干扰能力（特别是肌酐测定方法的不确定度和抗干扰能力）。

④回归误差。

考虑到各种误差的类型，指南建议eGFR偏离小于30%仍然是可以接受的。

在简化MDRD方程中的诸测定参数，肌酐测定的不确定度对eGFR的影响最大。

2003年美国病理学院（CAP）观察了80μmol/L没有基质效应的新鲜人血清在50个不同方法组间的测定变异，结果测定的SD为5μmol/L，以气相色谱-质谱法作为参考方法，观察常规测定结果与真值之间的差异，结果测定偏倚为-5.3-27μmol/L。

如果一年龄为60的女性患者血清肌酐值为88μmol/L，以简化方程计算得到eGFR为60ml/L，如果测定的方差为5.3μmol/L,eGFR变化的95%可信区间为53-69ml/min，eGFR测定偏差达±13%；如果测定的方差为10μmol/L,eGFR变化的95%可信区间为46-84ml/min，eGFR测定偏差达±30%。

在美国CKD教育计划实验室协作组提出肌酐测定的质量要求[ImprovetheprecisionofcreatininemethodstomeetthetotalerrorgoalforserumcreatininemeasurementdescribedinthepaperpublishedinClinicalChemistry2006;52

（1）:

5-18]，血清肌酐测定的不精密度<0.08mg/dL（<7.1µmol/L），与参考方法IDMS的偏差<0.05mg/dL（<4.4µmol/L）。

同时建议报告血清肌酐结果采用SI制时保留1位小数点位置，以传统单位mg/dl报告结果时应保留2位小数点。

三、人血清肌酐测定标准化研究进展

1．人血清肌酐测定的常规方法及不同测定系统间的变异

人血清肌酐常规测定方法有两类：

Jaffé碱性苦味酸动力学法和酶法。

碱性苦味酸法测定除有上述局限性外，还有同样都是Jaffé法，开放的自建系统与Beckman为代表的封闭系统间，在低于病理值时呈正偏差，高于病理值时呈负偏差，要把这两类方法测定的结果统一是非常有难度的。

2007年徐静等在中华检验医学杂志发表了北京13家31个血清肌酐测定系统的现场比对实验发现，测定均值为82μmol/L和92μmol/L的冰冻血清样本苦味酸测定的变异11%和10%，酶法测定变异为10.3%和8.5%,测定变异较CAP调查CV%明显偏大，不能满足临床的需要。

结果见图3。

不同系统间的差异与先前童清等发表的北京市48家三级医院临床化学现场调查结果类似。

这种从测定系统的统计上看，被调查的所有自建系统（A试剂配B家校准品，在C家仪器上测定）均没有采用配套的校准品，进一步的调查发现，所有自建系统，与Beckman原系统比较，在肌酐小于和大于200μmol/L，有明显的正（高至12%）和负偏差（低至-9%）。

测定均值为82μmol/L的样本在自建测定系统间的变异接近10%，而封密的Beckman系统测定小于4%。

由于自建立分析系统（英文称之为nonhomogeneoussystem）未经科学比对，是实验室间测定差异大的重要原因。

而酶法测定变异明显比苦味酸方法低，但酶法较苦味酸法测定结果系统偏低3.5-8.8%。

实验室间血清肌酐测定值的一致性和准确性（不确定度）不能达到临床的要求，使得估算eGFR的不确定度较大，可比性不理想，影响了eGFR的推广应用。

血清肌酐测定标准化是一个世界难题，我们国家临床诊断检测系统测定量值或校准的定值的溯源性研究刚刚起步，血清肌酐测定多为自建、未经严格比对的检测系统，因此肌酐测定的标准化工作格外困难，该项工作应该受到临床实验室、诊断试剂制造业、学术专业团体、质量控制和计量部门和政府的重视，应该组织力量，投入物力和财力集体攻关。

由于血清肌酐苦味酸测定的变异大，特别受血清内源性物质如胆红素、维生素C、蛋白质含量、溶血、药物等的影响，当重复性好，可以溯源到质谱的肌酐酶法测定方法问世后，肌酐碱性苦味酸动力学法测定的时代应该结束了。

当然在使用MDRD-EPI时，要求血清肌酐测定方法应采用酶法，肌酐酶法测定结果应该溯源到质谱法。

图32007年北京13家31个血清肌酐测定系统间变异调查

欧洲临床化学联邦共同体（EC4，EuropeanCommunitiesConfederationofClinicalChemistry）成立于1993年，属欧盟临床化学和检验医学机构，旨在协调欧盟范围内，隶属于IFCC及其欧洲分支（FESCC）的国家临床化学界和检验医学界的各项活动。

2008年EC4肌酐标准化工作组研究主要评价了欧洲范围内最常使用的肌酐检测系统的真实性。

该研究于2005年秋进行，真实性验证物质是参照美国国家临床检验标准委员会（NCCLS）C37-A指南要求制备，水平1的真实性验证物质采用新鲜人血清制备。

2和3水平是通过添加NISTSRM914a肌酐粉末获得，制备的物质按每瓶1ml分装保存于﹣80℃；物质的定值是在比利时L.Thienpont和Ghent教授的参考实验室，采用了JCTLM认可的参考方法—同位素稀释气相色谱/质谱法（ID-GC/MS）；定值的方法是每个样本在三个独立时段检测，每个时段测两次（n=6），三个独立时段的意思是在每个检测时段都要分别进行取样，样本前处理，校准和室内质量质控（NISTSRM909b1和b2）。

校准混合物来自三种独立准备的工作液。

方法的扩展不确定度预计达到1.5%~2%之间，三个水平的肌酐靶值分别为76.0μmol/L[水平1，变异系数（CV）0.5%]，153.4μmol/L[水平2，变异系数（CV）0.6%]，305.7μmol/L[水平3，变异系数（CV）0.4%]。

该研究选择了6个欧盟成员国（比利时，芬兰，法国，德国，意大利和荷兰），由实验参加国的国家室间质量评价（EQA）人员负责挑选具有代表性的实验室（比利时23个，芬兰17个，法国45个，德国27个，意大利40个，荷兰37个）采用不同的检测方法，最终有29个实验室（15%）采用补偿Jaffe法，103个实验室（54%）采用非补偿Jaffe法，33家实验室（17%）采用以肌酐水解酶为基础的酶法，19家实验室（10%）采用肌酐亚氨水解酶为基础的干化学法，5家实验室（3%）采用酶法紫外检测；采用不同的仪器，涉及的公司和仪器包括Abbott（AbbottPark，IL，USA；Aeroset，Architect），Bayer（Tarrytown，NY，USA；Advia1650），Beckman（Brea，CA，USA；Synchron），DadeBehring（Deerfield，MA，USA；Dimension），Olympus（Tokyo，Japan；AU640，2700，5400），OrthoClinicalDiagnostics（Rochester，NY，USA；Vitros），RocheDiagnostics（Mannheim，Germany；Integra，Hitachi,，Modular）andKonelab（Vantaa，Finland）；实验室严格按照仪器制造商的使用说明对物质进行分析（除外所有校正因子），并按要求提供试剂，波长，校准品，及使用的所有因素的信息。

计算总体均数、SD、每个实验室每个水平的平均值（使用相同方法的实验室的均值都排列在一组）以及总分析误差（TAE）。

通过使eGFR均方根的误差增加小于等于10%这一途径来限制肌酐检测的总预计误差。

研究结果显示：

中低浓度，Jaffe法和干化学法得出的值与靶值差别显著；高浓度，干化学法检出结果偏高。

室间变异系数为4.37%~8.74%。

偏差是造成总误差的主要原因，非补偿Jaffe法的结果远远超出了预计总误差，酶法得出的结果最佳，干化学法误差产生的主要原因是校准偏差，结果见图4。

研究结果提示尽管实验室自动化技术有了长足进步，肌酐标准化的需求也愈加迫切，在过去的十几年里，以Jaffe法为基础的检测方法的室间变异并未减小，这是不得不正视的现实；同时，该研究也指明了，标准化问题并不能改变分析干扰问题（非特异偏差），此外厂商也应通过与参考系统更好的校准来减小其方法的偏差。

图42005年对常用的肌酐检测系统精密度和正确度对eGFR估算影响的调查

2007年后美国CDC发布血清肌酐测定标准物质CRM567,后面还要介绍，该物质具有互换性可以用于常规方法的准确度考证。

美国病理学家协会同样也推出用于血清肌酐准确度验证的标准物质LN-24。

在此推动下，很多厂家在血清肌酐测定量值溯源方面作了大量工作，包括积水、罗氏酶法、强生新一代肌酐干化学酶法、贝克曼新一代苦味酸法、西门子苦味酸法和测定结果均具有良好的准确性，这些方法测定量值可以溯源到肌酐测定的最高标准ID-MS方法，他们的测定性能可以满足临床要求。

结果见表3。

（表3在另一文件夹中）

无论是溯源到ID-MS的酶法还市苦味酸法，其测定结果较传统的碱性苦味酸法测定系统偏低，因此肌酐酶法测定的参考值和苦味酸法应该不同，迄今也尚未见到采用溯源到质谱测定肌酐的参考值的权威报告。

椐北京大学第一医院王学晶和李海霞大夫尚未发表的资料表明，采用溯源到ID-MS的方法测定到男性血清肌酐测定结果显著高于女性，小于60岁组显著高于大于60岁年龄组。

血清肌酐小于60岁组和大于60岁年龄组男性和女性血清肌酐95%、97.5%和99%分位结果分别为：

87μmol/L，93μmol/L，102μmol/L和65μmol/L，60μmol/L，71μmol/L以及105μmol/L、109μmol/L、111μmol/L和77μmol/L、83μmol/L、91μmol/L。

2．肌酐标准物质的研究现状

NIST标准物质（SRM）914a为肌酐的纯度标准物质（结晶），用于参考方法的校准。

SRM914a的定标液是用肌酐纯品溶于缓冲液制备的，由于与血清基质不同，这种校准品用于常规方法的校准。

NIST标准物质SRM909-b-1、b-2和参考物质参考方法研究院（IRMM）提供有证参考物质（BCR573,574,575）为多水平的冻干人血清基质标准物质，其中肌酐的定值方法为气相色谱分离同位素稀释质谱法（GC-IDMS）。

这些标准物质可以用于较高一级参考测量程序的真值质控品。

虽然这种物质为人血清基质，但经过冻干等加工过程，其与病人新鲜患者血清间的互通性尚未证实，所以如果以上参考物质校准常规方法时，测定结果可能会出现偏差。

TheNKDEP,CAP,和NIST通力合作，采用添加肌酐纯度标准物质的方法