原核表达综述.docx
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原核表达综述
[Merck推荐]原核表达秘笈之宿主菌株选择指南
在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：
表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。
事实上，在平时的实验中，最容易被忽视的就是宿主菌的选择——多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株，或者是载体配套的菌株，而不去追究原因——即使表达结果不佳，大多在表达条件和载体上找原因，也不会考究菌株的选择是否适合。
作为原核表达的宿主，对外源基因的表达会产生一定的影响，是勿庸置疑的。
每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂，按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”——因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的，当出现问题时，我们需要经验判断问题所在。
宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢？
知其然还要知其所以然。
比如，菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。
堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。
大名鼎鼎的BL21（DE3）融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。
真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。
改造基因是比较麻烦的做法，Rosetta2系列就是更好的选择——这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG）稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
（已经携带有氯霉素抗性质粒）
当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时，可以选择K–
和glutathione
12衍生菌Origami2系列，thioredoxinreductase（trxB）reductase（gor）两条主要还原途径双突变菌株，显著提高细胞质中二硫键形成几率，促进蛋白可溶性及活性表达。
（卡那霉素敏感）
Rosetta-gami?
2则是综合上述两类菌株的优点，既补充7种稀有密码子，又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。
（卡那霉素敏感）
OrigamiB是衍生自lacZY突变的BL21菌株，这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物，使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。
（四环素敏感）
在决定试用这些名字古怪的菌株时，有几个小Tips要注意的，一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性，要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。
比如Rosetta2已经携带有氯霉素抗性质粒，不能再用氯霉素筛选等等。
现象
可能原因
改进方案
建议菌株
无蛋白表达
E.coli的密码子偏移性
补充稀有密码子的tRNA；将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子
Rosetta2
Rosetta-gami2Rosetta-gamiBRosettaBlue
出现截短蛋白
包涵体
二硫键形成困难
降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签
Origami2
Rosetta-gami2
Rosetta-gamiB
表达过快，表达量过高
蛋白错误折叠
控制优化表达水平：
降温，IPTG浓度优化
降低宿主胞质的还原性；利用促进二硫键形成的各种载体标签
Tuner
Rosetta-gamiB
Origami2
Rosetta-gami2
Rosetta-gamiB
蛋白无活性
控制优化表达水平：
降温，
IPTG浓度优化
Tuner
Rosetta-gamiB
细胞死亡，生长
极困难
毒性蛋白
更严格的本底表达控制
pLysS菌株
无克隆生长
过高本底表达
更严格的本底表达控制
pLysS、pLysE菌株
原核表达个人秘笈：
表达前的分析比什么都重要
表达不同于其它一些实验，比如：
提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。
表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。
原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。
当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。
原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。
做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。
首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。
前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。
同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。
当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。
如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。
比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。
根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。
在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：
1.翻译起始位点
现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子
2.GC含量
表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
GC含量可以利用DNASTA、RVectorNTISuite等软件进行预测。
3.二级结构
在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。
如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。
4.基因或者蛋白的大小
一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。
蛋白越小，越容易被降解。
在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。
如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。
对于另一个极端，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签，如6×组氨酸标签。
对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。
当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。
对于抗原性也可以利用软件分析，比如VectorNITSuite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结论，如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话还是不妨一试的。
5.亲疏水性
这也是一种经验之谈，相信经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高，如果你要表达一个膜蛋白，那么劝你做好长期抗战的准备吧。
有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析，比如VectorNITSuite，除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件http:
//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/对跨膜区进行预测。
对于自己表达的蛋白有所了解后就可以开始对载体进行选择了，目前商
业化的载体基本上包含以下几个元件：
除了上面标出的元件外还需要有复制起点，它对于控制质粒的拷贝数非常重要；另外就是筛选标记了，比如蓝白斑筛选的lacZ，各种抗生素标记。
在以上几个元件中，我们需要注意的是负责调节与启动的元件，也就是调控子和启动子。
其中启动子对于蛋白表达的速度起着举足轻重的作用，它与最终蛋白的表达量、是否可融密不可分。
这里，对于世面上广泛销售的几种原核表达载体使用的启动子进行总结。
启动子
来源
调控手段（浓度）
强度
LacUV5
乳糖操纵元
lacI/IPTG（0.1-1mM）
强
Trp
色氨酸操纵元
trpR3-β-吲哚丙烯酸
强
Tac
结合了色氨酸启动子的-35
lacI/IPTG（0.1-1mM）
强
序列和乳糖启动子的-10序列
PL
λ噬菌体
λcI阻遏物/温度
强
噬菌体T5pBAD
T5噬菌体
阿拉伯糖操纵元
lacI/IPTG（0.1-1mM）
AraBAD/阿拉伯糖（1μm-10mM）
强严谨
T7
T7RNA聚合酶
lacI/IPTG（0.1-1mM）
非常强
乳糖操纵子是应用最广泛的调控模式，除了IPTG这种化学诱导方式之外还有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化学诱导。
如果你害怕这些化学物质会损害细菌的生长，那么你可以尝试利用温度诱导的载体，如：
pDH2。
它利用PL启动子，在温度上升到42℃后进行诱导表达。
可以看到在所有启动子里属T7启动子最强，它可以将大肠杆菌的资源最大程度地调用过来表达外源蛋白。
这样一些难表达的蛋白都可以在pET系统里面表达出来，但是是不是越强就越好呢？
如果你需要表达蛋白是可溶的，那么T7启动子就不那么适合了。
较弱的启动子转录速度较慢，这样对于表达可溶、稳定、完整的蛋白比较有利。
Novagen可以说是的pET系统是最王牌的T7启动子表达系统，可是当T7启动子的强启动效应不受欢迎的时候怎么办呢？
在这里给读者留个小小的疑问，看看大家有没有仔细看笔者写的Novagen篇。
提示一下，虽然它转录速度快，但是可以控制它的拷贝数，又或者是⋯⋯利用这些原理Novagen载体也可以毒性高的外源蛋白。
载体上除了启动子这个需要注意之外，另外一个就是标签了。
很多标签是为了增加蛋白的可溶性，也有一些是为了方便鉴定表达产物，所以在表达时可以选择加标签。
是否加标签要看个人需要，笔者认为如果是表达一个人家没表达过的蛋白最好还是加标签，这样方便将来鉴定。
如果从经济角度考虑最好加入6
×组氨酸标签，笔者曾经以为加什么标签都无所谓（前提是不需要融合表达），结果加了个Novagen的T7·Tag，等到鉴定的时候发现单抗那么贵。
而且还不好买的，一些较少人用的标签会让你很伤脑筋。
这也是表达前要准备的功课之一哦。
好了，如果你选好了载体，那么下一步就是设计引物的。
相信大多数人都是利用PCR把目的基因调出来的吧。
设计引物可以使用一下两个软件，PrimerPremier或者Oligo。
如果要表达全长，其实也就没那么多要考虑，从一头一尾找至少8个匹配序列在加上与载体匹配的序列就可以了。
不过，我还是有以下几点提醒一下各位：
1.这一点其实很容易理解，但是有时也容易被遗忘。
那就是先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，不要设计重了，否则酶切时发现怎么老是有预期外的小片段出现。
2.根据载体上的酶切位点设计引物，现在许多类似T载原理的克隆方法也可以应用到原核表达中了，如果T载克隆方法要定向很多时候要多加4个碱基，设计引物时候可别忘了加。
在设计酶切位点的5'端不要忘了加保护碱基，不同内切酶所需的保护碱基不同，SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，HindⅢ最好有3个。
一般情况下，都设计2个。
3.注意启始密码子和终止密码子的读码框。
如果载体上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，如果中间含有载体序列，务必确定中间这段序列不会造成你外源序列的移码。
按情况需要，可以加1到2个碱基在引物中使读码框正确。
有始有终，同样正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。
大部分载体也有终止密码子，如果你对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子，这样万无一失。
4.还有就是设计一对引物需要注意的地方：
一对引物之间Tm值相差不宜过
大，能一样最好；一对引物不宜形成发夹结构、互相配对，若配对时最好不要是G-C的结合（可以用软件分析）；3'端以G、C结尾为宜等等。
如果要详细研究可以看一下PCR技术的相关书籍，很厚。
还有就是记得把上游引物设计成有义链，下游设计成反义链，否则就没有片段出现了。
虽然这是很小的地方，可是经常会被忽略。
5.如果你是进行截取表达，那么除了之前提到的要注意截取亲水区，还有一点就是对密码子的使用频率进行分析。
如果在大肠杆菌中使用较少的密码子在外源片段中连续出现，还是避开它为上策。
因为纯化爱上你:
原核表达GE（原安玛西亚）篇
讲起通用电气医疗集团（GEHealthcare）也许生物方面的研究人员会比较陌生，这个从爱迪生的灯泡讲起，拥有百年历史的大集团包括许许多多的行业（当然也不要盲目崇拜把通用汽车也归到旗下，GM会生气的），可是讲起蛋白纯化等领域首屈一指的安玛西亚，特别是ECL系列和当年的法玛西亚的Sepharose、Sephadex等大名鼎鼎的纯化填料，那么许多做蛋白的人都很熟悉。
美国通用电气公司2003年10月以总计高达95亿美金获得安玛西亚公司100%的控股权，这就是轰动一时的仪器行业内最大的收购案之一。
选择GE的表达载体原因很简单，爱屋及乌，使用他们的载体可以方便下一步的纯化。
虽然在这几篇的介绍中没有强调纯化这个步骤，但是这不是因为纯化不重要，而是因为它太重要了。
涉及的内容太多，根本可以作为一门学科来了解，所以就不把“战线”拖那么长了。
但是在选择表达系统的时候，表达后的纯化方法是必需考虑的非常重要的问题之前我们提到的经常用于标记的蛋白包括有硫氧还蛋白、6×组氨酸、谷胱甘肽S转移酶（GST）等，6×组氨酸可以说是被应用的最为广泛的了，次之就是GE医疗有专门设计的一系列载体的GST了。
GST本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。
将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到一种促进表达量提高的作用。
6xHistag因为分子量很小且通常认为不会显著影目标蛋白的活性，在不太严谨的实验中经常不需要切割就可以继续分析目标蛋白（严格的实验还是必需切割下来的）。
但是GST相比6xHistag分子量要大得多，必需要用蛋白酶将融合蛋白中的GST切下来。
对于表达分子量小的目标蛋白来说选择GST就比6xHistag更有优势——融合蛋白分子量较大的比较不容易被降解，另外有时天然蛋白里可能存在5个连续的组氨酸（或者非常靠近的6个His）因而也会被6xHis纯化填料吸附而“混入”纯化队伍中，而GST纯化填料的专一性则非常高。
顺带提一句，GST融合表达得到的包含体经过纯化后在复性的过程中添加适量的谷胱甘肽明显有助于提高融合蛋白的复性比率（在还原剂不影响二硫键的条件下）。
选择GST载体的同志不可不知。
GST系列可是说是GE医疗在原核表达这块的王牌产品，总共有13个载体。
这13个载体中有9个的多克隆位点是扩展过的，有6个限制性酶切位点。
扩展后的多克隆位点方便我们从λ噬菌体载体构建的文库中将所需的基因克隆出来并定向插入到表达载体中。
所有载体上都带有可以将GST切割下来的蛋白酶识别位点，不同载体携带的蛋白酶不同，可以分成T系列、X系列和P系列，分别代表采用凝血酶Thrombin、Xa因子蛋白酶以及GE医疗产的PreScission?
蛋白酶作为蛋白酶切割位点。
前面两个都是非常经典的融合表达载体的蛋白酶切割位点，但是由于这两种蛋白酶切割需时较长而且要求在室温条件下切割GST，容
易导致目标蛋白降解，另外蛋白酶的去除也是比较烦人的问题，所以GE公司就
推出了新的系列：
PreScission。
P系列载体是用PreScission?
酶进行切割，它的消化温度只要5°C，可以最大程度减小对目的蛋白的降解作用。
因为这个蛋白酶本身通过基因操作也加上了一个GST标记，所以它可以和被切下来的GST残余部分一起通过谷光甘肽凝胶柱（GlutathioneSepharose?
）纯化去除。
这样就可以极大程度上简化了纯化的步骤，从这里可以再次看出GE医疗产品在设计上很多时候总是考虑到下一步的纯化步骤的。
pGEX-6P有三种载体，以方便你从不同的酶切位点插入都不会造成移码突变。
另外值得一提的是pGEX-2TK是专门为了体外标记融合产物以检测表达情况而设计的。
它含有来自心肌的cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位的识别位点，
这个位点位于GST和多克隆位点之间。
表达的蛋白可以直接用蛋白激酶和
[g-32P]ATP进行标记，产物可以用放射自显影技术稳定地检测。
它的GST可以
用凝血酶切除。
总的说来，pGEX所有载体都提供了三种不同的翻译读码框选择；都是利用乳糖操纵子调控模式，启动子都是Ptac。
Ptac是由trp启动子的-35序列和lacUV5的Pribnow序列拼接而成，调控和lac一样，但是mRNA转录水平更高，表达也更高，也都利用IPTG进行诱导表达。
IPTG本身有毒而似乎不适合表达医药用途的蛋白。
这系列载体都是利用氨苄青霉素进行筛选。
其中pGEX-1lT，
pGEX-6P-1，pGEX-4T-1和pGEX-5X-1都可以接受来自lgt11文库的cDNA片断并进行表达。
在表达后的检测和纯化方面，GE医疗的产品堪称经典。
无论是WesternBlot检测表达，还是五花八门的纯化亲和层析柱，还有分离凝血酶等丝氨酸蛋白酶的苯甲脒凝胶柱，即使GE医疗没有6×组氨酸标记的载体，但是6×组氨酸亲和纯化相关产品却绝对出色。
极速浓缩、1分钟洗脱，不同规格的柱子10月期间一直在特价，详细情况可参考生物通首页头条广告。
这里就不详细一一介绍了。
大家做原核表达的目的是各式各样的，有用来做抗原；也有需要表达量大，并且需要活性的产物。
纯化是表达后绝对不可小视的一步。
所以，回到开场白“因为纯化爱上你”，就是选择pGEX的最好理由吧！
优化基因表达的关键因素之：
基因的重新设计和合成
与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。
基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实
现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。
以下就密码子
最佳化、翻译终止效率和真核细胞中异源蛋白表达的问题加以说明。
密码子最佳化（codonoptimization）
遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。
那些被最频繁利用的称为最佳密码子（optimalcodons），那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子（rareorlow-usagecodons）。
实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。
大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用[1]。
有趣的是，灵长类和酵母有6个同样的利用率低的密码子。
大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。
因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。
你的基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，这种情况是可能的。
利用偏爱密码子（preferredcodons）并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因，基因的这种重新设计叫密码子最佳化。
在同源表达系统中，同较低水平表达的基因相比，较高表达的基因可能有很不同的密码子偏爱。
通过对密码子利用的归类分析，人们可以真正预测任何基因在酵母中的表达水平[2]。
在诸如Zeamays的其他生物中，大量高表达基因
强烈偏爱以G或C结尾的密码子[3]。
而且，在Dictyostelium中，同低水平表达的基因比较，高表达基因有较大数目的偏爱密码子[4]。
在大肠杆菌中表达哺乳动物基因是不可预测和具有挑战的。
例如直到最近才实现了人血红蛋白的过表达[5]。
为了达到血红蛋白的好的表达水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大肠杆菌偏爱的密码子进行重新合成。
在异源宿主中实现象血红蛋白这样复杂的蛋白质的过表达可能需要最佳化密码子，这些研究者为此提供了令人信服的资料。
成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。
核糖体翻译由九个密码子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。
即使低利用率密码子簇位于3'端，
信使最后也会被核糖体”拥挤”而损害，核糖体又回到5'端。
3'端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。
如果低利用率密码子簇位于5'端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。
散在分布的稀有密码子对翻译的效应还未很好地研究，但是有证据表明这种情况的确对翻译效率有负面效应[6]。
其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。
重新设计合成基因可以去除或改变这些序列，导致高水平表达。
消除稀有密码子、去除任何去稳定序列和利用最佳密码子的基因的重新设计都可能增加蛋白产量，使的蛋白生产更有效和经济。
翻译终止效率
蛋白表达水平受许多不同因素和过程影响。
蛋白稳定性、mRNA稳定性和翻译效率在蛋白生产和积累中起主要作用。
翻译过程分为起始、延伸和终止三个期。
对于翻译的起始，原核mRNA需要5'端非翻译前导序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特异核糖体结合序列。
在真核细胞，有效的起始依赖于围绕在起始密码子ATG上下游的一段叫Kozak序列的序列。
密码子利用或偏爱对延伸有深刻的影响。
例如，如果mRNA有很多成簇的稀有密码子，这可能对核糖体的运动速度造成负面影响，大大减低了蛋白表达水平。
翻译终止是蛋白生产必须的一步，但其对蛋白表达水平的影响还没有被研究清楚。
但是最近的科学研究表明终止对蛋白表达水平有很大的影响。
总的来说，更有效的翻译终止导致更好的蛋白表达。
绝大多数生物都有偏爱的围绕终止密码子的序列框架[7]。
酵母和哺乳动物偏爱的终止密码子分别是UAA和UGA。
单子叶植物最常利用UGA，而昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA。
翻译终止效率可能受紧
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