环境科学概论 实验讲义.docx

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环境科学概论实验讲义

实验一、高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量

一、实验目的：

1、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理；

2、掌握高效液相色谱仪的操作；

3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量的基本方法；

4、掌握标准曲线定量法。

二、实验原理：

咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称1,3,7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。

它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。

咖啡中含咖啡因1.2%－1.8％，茶叶约含2.0%－4.7％。

可乐、APC药片中均含有咖啡因。

其分子式为C8H10O2N4，分子量194.19，其结构式为：

用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其他组分（如：

单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统，以紫外检测器进行检测。

在整个实验过程中，流动相流速和泵的压力是恒定的，测定他们在色谱图上的保留时间和峰面积后，可直接用保留时间定性，用峰面积作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。

三、仪器和试剂

1、仪器

Agilent1200高效液相色谱仪；

色谱柱（C18）：

4.6mm×250mm、粒径5μm；

平头微量进样器：

5.0μl

2、试剂：

1咖啡因（A.R.）、甲醇（色谱纯）、超纯水、可口可乐（瓶装）

②1000μg/mL咖啡因储备液：

将咖啡因在110℃下烘干1小时，准确称取0.1000g咖啡因，用超纯水溶解，转移至100mL容量瓶中，定容至刻度，待用。

四、实验内容：

1、色谱条件：

柱温：

25℃；流动相：

甲醇／水＝40：

60

流速：

1.0mL/min检测波长：

275nm

2、咖啡因标准系列溶液配制：

分别用移液枪吸取1000μg/mL咖啡因储备液1.0、2.0、2.0、4.0、5.0mL于5只50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，浓度分别为20、40、60、80、100μg/mL。

3、样品前处理：

①将25mL可口可乐置于100mL烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶净二氧化碳。

2取5mL可乐溶液用0.45μm的滤膜过滤，然后注入2mL自动进样瓶备用。

4、绘制工作曲线：

待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液5.0μl，重复两次，要求两次所得的咖啡因色谱峰面积基本一致，记下峰面积与保留时间。

5、样品测定：

分别注入样品溶液5.0μl，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，重复两次，记下咖啡因色谱峰峰面积。

五、结果处理：

1、确定标准样咖啡因和样品中咖啡因的保留时间及记录不同浓度下其峰面积；

2、根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。

3、根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计算可口可乐中咖啡因含量（μg/mL）

六、注意事项：

1、液体样品必须经过处理，不能直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱的寿命。

2、为获得良好结果，样品和标准溶液的进样量要严格保持一致。

七、思考题：

1、用标准曲线法的优缺点是什么？

2、解释用反相色谱柱测定咖啡因的理论基础。

3、在样品干过滤时、为什么要弃去前过滤液？

这样做会不会影响实验结果？

为什么？

实验二、气相色谱联用法分离多溴联苯醚（PBDEs）方法的建立

一、实验目的：

1、掌握气相色谱仪的结构和测定原理；

2、掌握如何运用气相色谱仪分离多种PBDEs。

二、实验原理：

多溴联苯醚（polybrominateddiphenylethers，简称PBDEs）属于溴系阻燃剂（brominatedflameretardants，简称BFRs）的一种，由于其阻燃效率高，热稳定性好，添加量少，对材料性能影响小，价格便宜，因而作为一种添加型阻燃剂被广泛地应用在电子、电器、化工、交通、建材、纺织、石油、采矿等领域中。

PBDEs的的化学通式为C12H（0~9）Br（1~10）O，依溴原子数量不同分为十个同系组,共有209种同系物。

PBDEs在室温下具有蒸气压低和亲脂性强的特点,沸点为310～425℃,在水中溶解度小。

PBDEs具有相当稳定的化学结构,很难通过物理、化学或生物方法降解。

其分子量为结构式为：

本实验将运用气相色谱仪分离多种PBDEs。

三、仪器和试剂

1、仪器

Agilent6890气相色谱仪，色谱柱：

DB-5MS（15m、0.25mm、0.1μm）毛细管柱；

2、试剂：

3PBDEs混标（浓度10ppb）：

BDE-47、99、100、153、154、183五种物质被选为多溴联苯醚的代表性物质。

均购自Accustandard公司（NewHaven,CT,USA）。

4试剂：

异辛烷为分析纯。

四、实验内容：

1、色谱条件的优化：

载气：

氮气（99.999%）；流速：

1.0mL/min不分流进样；进样量：

1.0μL

进样口温度：

280℃检测器温度：

290℃

柱温程序升温：

初始温度100℃,保持1min,以30℃/min升温至240℃，保持1min,然后以3℃/min升温至280℃，保持5min,。

2、标样的测定：

在最优的色谱条件下，分别注入标准溶液1.0μL，根据保留时间确定样品中各PBDEs色谱峰的位置，重复两次，记下各峰保留时间（tR）、面积（A）及分离度（R）。

五、结果处理：

1、记录标准溶液中各PBDEs色谱峰的保留时间和峰面积；

2、根据标样色谱峰的保留时间和判断各PBDEs是否完全分离；

（R<1：

未分离；R=1：

基本分离；R=1.5：

完全分离）

3、找出各物质信噪比（S/N）。

六、思考题：

1、影响各物质峰分离度的因素有哪些；

3、据各物质信噪比（S/N）计算各物质检出限（LOD）；

2、气相色谱检测器的分类及适用对象；

高效液相色谱仪（Agilent-1200-HPLC）操作规程

一、开机

1、开机前准备：

流动相使用前必须过0.45μm的滤膜（流动相必须为色谱纯，水相必须用新鲜纯净水，不能用超过3天的纯净水，以防止长菌或长藻类）。

2、打开UPS电源，打开电脑，进入windowsNT系统后，调用CAGBootpSever。

3、打开高效液相色谱仪各模块电源开关，等待仪器和电脑成功连接。

4、双击联机图标，仪器自检成功后，进入Agilent工作站。

5、从“视图”菜单中选择“1方法和运行控制”界面。

根据分析物对应的分析方法选择A、B、C、D流动相，设置流动相流速（一般为1.0mL/min），设置柱温，设置检测器波长和检测器量程，在控制界面中，点击系统运行ON按钮。

6、显示窗中观察基线情况，待基线平直后方可进样。

二、关机

1、关机前，流动相若用过缓冲盐溶液，必须先用100%的水冲洗系统（打开排液阀，调流速为3.0mL/min，冲洗约5min，然后调流速为1.0mL/min，关闭排液阀，再冲洗约20min），然后再用甲醇或乙腈以同样的方法冲洗20min后关泵。

2、退出化学工作站及其它窗口，关闭计算机。

3、关掉Agilent1200电源开关。

关机时，在色谱工作软件控制界面中，点击系统运行OFF纽，待系统压力降至5bar以下时，关高效液相色谱仪各模块电源开关，最后关UPS电源开关。

4、清理台面，保持整洁，按有关规定详细填写仪器使用记录。

三、注意事项

1、更换有机溶剂时，若气路中有气泡时，应从旁路彻底排除气泡。

2、若柱子使用时间较长，柱压较高时，可采用柱子再生法处理，即按水-甲醇-四氢呋喃-二氯甲烷-四氢呋喃-甲醇-水的顺序来冲洗柱子，以提高柱子的柱效和寿命。

气相色谱仪（Agilent6890--GC）操作规程

一、开机：

1、打开载气（N2或He）、空气、氢气等气瓶的总阀开关，调整载气、空气输出气压约为0.5MPa（FPD空气应调到0.6MPa），氢气调整为0.2MPa。

（若有ECD，把ECD的排气管堵头去掉）

2、开启载气氮气总阀，使氮气分阀压力为0.4Mpa左右

3、打开电脑，打开BootpSever程序窗口，然后打开Agilent6890-GC仪开关，待仪器自检完毕后，BootpSever程序窗口显示数据Staus,工作正常后使此程序窗口最小化（注意千万不要关闭），双击电脑桌面的Instrument1online图标，使GC化学工作站与Agilent6890-GC仪器联机通讯；

4、进入GC化学工作站（Method&RunControl界面），调用或者编辑相应的操作方法。

设置进样口温度、柱箱温度、检测器温度、待温度达到设定值后，开启氢气、空气电源（FID检测器，并以合适氢空比点火）

5、设置分析样品时所需要的条件（如进样口温度、柱箱温度、检测器温度、载气流速、分流比等）；

6、待基线走平稳后，方可进样分析。

二、关机：

1、将进样口、柱箱、检测器温度设置在50ºC下；

2、然后根据仪器配备的情况把FID/FPD的Flame（点火）off、NPD的Bead（铷珠电压）off、TCD的Filament（灯丝）off；

3、待温度降为设定值后，先退出Instrumentonline程序，再依次关闭GC仪开关、BootpSever程序窗口及计算机电源。

4、最后关闭氮气、空气及氢气总阀。

连续流动注射仪分析仪（AA3）操作步骤

连续流动注射仪分析仪（AA3-AutoAnalyzerⅢ）

1、打开所有电源。

检查所有的管道是否安装无误，滤光片是否更换，加热和紫外消化是否连接等等。

如果有活化剂的管道，先把它放入活化剂中，其余管道放入蒸馏水，把泵的速度调到快速进行清洗。

2、打开AACE软件。

 建立或编辑分析文件（根据需要）。

建立或编辑运行文件。

在系统窗口中单击“charting”进行联机，关闭不需要的通道窗口，对于新建立的方法设置自动灯。

在每一个通道窗口中点鼠标右键选Autolamp，左下角会出现“autolampinprogress”，稍等，出现灯值“lampvalue：

XX”。

在每一个通道窗口重点鼠标右键选AutoBase，设置基线高度。

3、基线平稳后，把管道放入对应的试剂瓶中，把泵速调到慢速，检查试剂吸收。

如果基线不平稳，检查管路中的气泡。

等待通入试剂的基线稳定后，再单击“setbase”。

4、 设增益。

打开进样器，使样品针开始吸样，保持1.5分钟后关闭，使样品针回到清洗处。

等待出峰，当峰上升至最高点并保持平稳时，单击右键，在下拉菜单中调节增益，单击“setgain”。

5、设完增益，再次等待基线平稳，然后“setbase”。

6、在主菜单中，单击“stop”，然后单击“run”，选择设置好的运行文件。

7、运行开始。

8、运行结束后，也会自动出现提示对话框，按“yes”，完全结束分析。

清洁所有管路。

假如方法没有具体指出某种清洗液，一般使用去离子水和活化剂清洁系统。

9、把泵的速度调到快速，吸入清洁液约10分钟以上，直到管道清洁干静。

然后再用蒸馏水或二次水清洁15分钟以上（如果长时间不使用，把所有管路置于空气中，排干水份）。

关掉泵的电源，取下泵的压盖，放松泵管，把压盖倒扣在泵上。

10、关闭所有电源，断开所有连接。

TOC/TN（总有机碳/总氮）仪器操作步骤

1、打开仪器电源开关。

2、打开载气阀门。

高纯空气，流速150ml/min。

3、打开计算机。

4、打开TOC-ControlV软件的主菜单。

5、使用NewSystem功能建立需使用的系统；若已经建立则跳过此步骤。

6、从TOC-ControlV软件的主菜单中打开SampleTableEditor。

7、联机Connect。

（预热时间约30分钟。

）

8、若要作标准曲线，则先从New中选CalibrationCurve建立标准曲线模板；若要作未知样品，则先从New中选Method，建立方法模板；（也可以不在此建立，从Insert插入Sample，然后使用其他标准曲线的参数设置或手动设置。

）若要作控制样品，则先从New中选ControlSampleTemplate，建立控制样品模板。

若已经建立好所需模板，则跳过此步骤。

9、打开新的样品表。

从New中选SampleRun，建立新的样品表。

软件自动给出新的样品表名。

10、根据测定需要，从Insert中插入CalibrationCurve、Sample或者Control，分别对应测定标准曲线、未知样品，或者控制样品。

11、软件联机，点击

12、点击Start，开始测定。

13、从View中选择SampleWindow，可实时看到样品出峰情况。

14、实验结束。

结果自动保存。

15、关机。

从Instrument中选择Standby，确定后载气立刻停止，可以关闭载气阀门。

炉内自动降温，半小时后仪器电源自动关闭。

Multiwave3000微波消解操作步骤

一、开机：

插上电源后直接黑色开关按钮

二、方法设置

2.1.从主菜单按键进入程序库界面。

该菜单主要包括3个部分:

•"Last"显示最近四次的工作程序，主要用于常规使用、可快速进入经常使用的方法。

•"MakeNewSample"用于新建样品方法。

•"Library"按字母序列排列的方法库。

主要包括与所使用的转子相关程序。

•通过上下键或和左右键可选择某个程序，按键确认选择

•使用左右键或可直接在三个部分之间切换。

2.2．直接调用方法库中的发法或调用方法后编辑使用

通过选择（"Last"）及（"Library"）中的方法，由确认选择，进入下图界面；

•Start（开始）

选择该键就开始启动所显示的样品消解程序，仪器自检。

•Edit（编辑/修改）

选择该键后可以对所显示的方法进行修改

•Notes（备注）

本选项可以添加附加信息，这些附加信息可以与方法一起被保存。

•SplDoc（SampleDocumentation样品纪录）

注意：

消解程序建议设定参数：

P-Rate设为0.2bar/s；IR最高：

200℃，P最高：

35bar；最高功率：

600w（4罐）；800w（8罐）；1400w（16罐）

2.3新建新方法

选择"MakeNewSample"，进行编辑，

编辑完成后，按退出，仪器会自动出现是否需要保存的对话框。

-New（新建）:

按可将修改的方法作为新方法保存。

-Discard（放弃）:

按取消对方法的修改。

注意：

萃取程序必须选择T-program，而不是P-program，且温度设120℃-Rate设为0.2bar/s；IR：

100℃；

三、消解预处理步骤

3.1样品称量及加相应的溶剂

A：

秤适当重量的样品到内管中，当心防止样品粘在罐口密封处。

B：

往管内加入消解试剂/萃取溶剂，将粘在管壁上的样品全部淋洗到底部，并轻轻混匀。

注意：

消解未知样品时，建议单个样品称样量不超过0.5g，加酸量一般为8~15ml；萃取时单个样品量不超过2g，萃取溶剂一般为10~25ml。

3.2安装消解罐各步骤

3.2.1密封盖操作

消解罐通过螺帽盖进行密闭，具有自密闭功能的PTFE-TFM缘式密封，在加热过程中压力升高，密封边缘被压向内管壁，形成对消解罐的密封。

密封盖较敏感，为了保证其正常的功能，避免试剂或元素的损失，密封必须按照以下要求进行仔细操作：

A.将密封盖完全压入到密封器上至少3秒钟。

新密封应该压10秒钟以上。

B.立即轻软地将密封盖入消解罐内，并旋紧螺盖。

为保证密封性，应该在15分钟内开始消解反应。

否则应该重新压密封。

C.对p/T传感器或p传感器进行相同的密封扩充操作。

3.2.2消解管操作

A.请保证压力套管及内管的外侧的干燥，不得有任何残留水或酸液

B.将内管放入到压力套管内。

C.手指拧紧螺盖上的放气螺杆。

D.小心将刚扩好密封的螺盖放到消解罐上。

E.顺时针手旋紧螺盖。

3.2.3转子操作

A.将有传感器的参比罐放在1号位。

.

注意：

1号位必须放有传感器的样品，不得为空白。

B.将其他消解罐放入到转子内的其他位置，排气螺杆朝外，并注意均匀对称排列

C.将保护罩盖到转子上，转子罩外侧的箭头对准转子上的"OPEN"位置。

D.顺时针旋紧保护罩至箭头指向"CLOSE"位置，卡口锁定。

四、消解过程

4.1仪器自检

按2.2或2.3步骤调用或编辑方法，按start键开始仪器自检。

在样品程序菜单中按键后，就进入到预检过程，自动检测炉腔内是否有转子及转子的类型、转子的保护罩是否已盖上。

如果配置有相关的温度或压力传感器，自检阶段将对传感器功能进行检查

如果在自检过程中发现错误，将显示错误提示信息，方法启动将被中断。

如果自检通过，就可以按绿色的按钮，就进入到运行（Run）模式。

4.2消解过程的终止

A.暂停：

消解过程中可以按一次，可暂停微波加热，但继续监测温度和压力，再按一次键，可继续消解程序。

B.终止：

如果要终止消解程序，连按两次键，消解将被终止，安全冷却风机启动。

4.3消解结束

A.消解完成并至安全冷却停止时，屏幕上将显示四个选项：

•Print:

（打印）

如果连接了打印机，选择该项可以将消解数据（包括温度压力曲线图）打印出来。

•Send:

（发送）

将消解的相关数据传送到外接电脑上。

•Review:

（回看）

在显示屏上查看消解过程的相关数据，并可发送到外接电脑上和打印机上。

•NextRun:

（下一次）

回到样品菜单界面，可修改或再次消解。

注意：

消解结束后，请勿将消解罐长时间留在炉腔内，以避免密封在冷却后收缩，导致腐蚀性气体污染仪器、转子、和消解罐相关部件。

B．按动机身顶部的开门按钮，打开安全门。

C．如果直接在炉腔内进行排气，请将程序提示，用“+F2”、“-F3”键将排风开启到2或3。

或将整个转子搬到通风柜内。

D．请排气扳手通过保护罩的小孔插入到排气螺杆中，缓慢反转，不超过一周。

也可以在打开保护罩后进行排气。

E．逆时针旋转保护罩止停止位，上提取下保护罩，正放在干净的台面上（可作内管和螺盖的搁架。

稍等片刻等酸气全部散尽。

五、关机：

直接按黑色的开关按钮。

Multiwave3000微波萃取操作步骤

1、开机：

插上电源，打开下面的黑色按钮。

2、方法设置：

2.1.、从主菜单按键进入程序库界面。

该菜单主要包括3个部分:

•（"Last"）显示最近四次的工作程序，主要用于常规使用、可快速进入经常使用的方法。

•"MakeNewSample"用于新建样品方法。

•（"Library"）按字母序列排列的方法库。

主要包括与所使用的转子相关程序。

通过上下键或和左右键可选择某个程序，按键确认选择.

使用左右键或可直接在三个部分之间切换。

2.2直接调用方法库中的发法或调用方法后编辑使用

通过选择（"Last"）及（"Library"）中的方法，由确认选择，进入下图界面：

•Start（开始）

选择该键就开始启动所显示的样品消解程序，仪器自检。

•Edit（编辑/修改）

选择该键后可以对所显示的方法进行修改

•Notes（备注）

本选项可以添加附加信息，这些附加信息可以与方法一起被保存。

注意：

1、消解程序建议设定参数：

P-Rate设为0.3bar/s；IR最高：

200℃，P最高：

35bar。

最高功率：

600w（4罐）；800w（8罐）；1400w（16罐）2、萃取程序必须调用SOLV开头的方法，P-Rate设为0.2bar/s；IR：

100℃。

2.3新建新方法

选择"MakeNewSample"，按提示所示进行编辑

编辑完成后，按退出，仪器会自动出现是否需要保存的对话框。

-New（新建）:

按可将修改的方法作为新方法保存。

-Discard（放弃）:

按取消对方法的修改。

注意：

萃取程序必须选择T-program，而不是P-program，且温度设120℃，p-Rate设为0.2bar/s；IR：

100℃；

3、微波萃取预处理步骤

3.1样品称量及加相应的溶剂

A：

秤适当重量的样品到内管中，当心防止样品粘在罐口密封处。

B：

往管内加入萃取溶剂，将粘在管壁上的样品全部淋洗到底部，并轻轻混匀。

注意：

萃取时单个样品量不超过2g，萃取溶剂一般为10~25ml。

3.2安装萃取罐各步骤

3.2.1密封盖操作

萃取罐通过螺帽盖进行密闭，具有自密闭功能的PTFE-TFM绝缘式密封，在加热过程中压力升高，密封边缘被压向内管壁，形成对萃取罐的密封。

密封盖较敏感，为了保证其正常的功能，避免试剂的损失，密封必须按照以下要求进行仔细操作：

A.将密封盖完全压入到密封器上至少3秒钟。

新密封应该压10秒钟以上。

B.立即轻软地将密封盖入消解罐内，并旋紧螺盖。

为保证密封性，应该在15分钟内开始萃取反应。

否则应该重新压密封。

C.对p/T传感器或p传感器进行相同的密封扩充操作。

3.2.2萃取管操作

A.请保证压力套管及内管的外侧的干燥，不得有任何残留水或溶液。

B.将内管放入到压力套管内。

C.手指拧紧螺盖上的放气螺杆。

D.小心将刚扩好密封的螺盖放到萃取罐上。

E.顺时针手旋紧螺盖。

3.2.3转子操作

A.将有传感器的参比罐放在1号位。

.

注意：

1号位必须放有传感器的样品，不得为空白。

B.将其他萃取罐放入到转子内的其他位置，旋紧罐盖并注意均匀对称排列。

四、消解过程

4.1仪器自检

按2.2和2.3设定的程序步骤调用或编辑方法，按start键开始仪器自检。

在样品程序菜单中按键后，就进入到预检过程，自动检测炉腔内是否有转子及转子的类型、转子的保护罩是否已盖上。

如果配置有相关的温度或压力传感器，自检阶段将对传感器功能进行检查

如果在自检过程中发现错误，将显示错误提示信息，方法启动将被中断。

如果自检通过，就可以按绿色的按钮，就进入到运行（Run）模式。

4.2萃取过程的终止

A.暂停：

萃取过程中可以按一次，可暂停微波加热，但继续监测温度和压力，再按一次键，可继续萃取程序。

B.终止：

如果要终止萃取程序，连按两次键，萃取将被终止，安全冷却风机启动。

4.3萃取结束

A.萃取完成并至安全冷却停止时，屏幕上将显示四个选项：

•Print:

（打印）

如果连接了打印机，选择该项可以将萃取数据（包括温度压力曲线图）打印出来。

•Send:

（发送）

将萃取的相关数据传送到外接电脑上。

•Review:

（回看）

在显示屏上查看萃取过程的相关数据，并可发送到外接电脑上和打印机上。

•NextRun:

（下一次）

回到样品菜单界面，可修改或再次萃取。

注意：

萃取结束后，请勿将萃取罐