酶切若干问题.docx
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酶切若干问题
酶切现象及影响因素详解
1先说一下酶切对象
（1）质粒要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase和残留质粒提取中的酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除干净。
以上所提的这些这都会影响酶切效果。
解决方法DNase污染：
质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换，以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，容易降解DNA.在最后溶解DNA时，可以采用TE和水，建议用TE，TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。
酶切时，TE也会有一定影响，但你可以将溶解DNA时的TE少加点。
酶切时，取的DNA的体积就可以减少，经水稀释，就问题不了。
RNA的去除：
一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除1－2个小时就行。
酚的污染：
首先在用酚仿抽提时，就要小心不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下，就可以很好的避免酚的残留。
高盐的去除：
提取质粒时一般盐的浓度很高，若有人在70％乙醇洗盐这步不做，也会影响后面酶切。
（2）PCR产物PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，若是杂带很多，就要将目的片段回收再酶切。
一般在设计引物的时候，会在5'端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。
加入4个比较保险，如果没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的，即使加入保护碱基，酶切效率也会较低，需要长时间酶切。
（3）基因组DNA将基因组做酶切一般是在southernblot时常用，这时酶切体系一般较大，因为基
因组中目的基因的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获得较好的杂交效果。
内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。
2酶切试剂
（1）酶切缓冲液：
一般公司会给你的说明书中，告诉你用哪种缓冲液，如果是单酶切，按照说明书上提示即可。
要是双酶切，原则是先找两种酶有没有可以共用的缓冲液，最好两种酶同时酶切比较省事。
实在是两种酶没有共用缓冲液，就得先进行低盐缓冲液酶切，补充适量盐溶液，再行高盐的缓冲液进行酶切。
（2）限制性内切酶：
一般是在－20度保存，吸取时，从冰箱取出后放在冰上进行操作，而且动作要快，防止酶失活。
有的人，将酶分装几管，每次拿出一管来用，可以更好的避免酶失活。
国产的内切酶，比如常用的EcoRIBamHI还可以，但是其他一些酶质量不如国外的可靠，有时你的酶切若出现smear的现象时，总是找不到原因，有可能就是酶中的污染。
3酶切目的
（1）加入多少目的DNA,这要看你的酶切目的是什么,如果你要是回收目的片段，当然是多一些好，而且在电泳之前要更换电泳液，以免污染。
要是只进行酶切鉴定，就可以少加一些目的片段。
（2）如果单一的目的片段酶切连接，在酶切之后要将酶进行加热失活，或者用酚氯仿进行抽提，纯化。
（3）要获得不完全酶切的产物，一般都是控制酶切的时间，进行梯度延长酶切，可以获得你所要的最佳酶切时间。
4酶切温度
一般常用的内切酶都是在37度是最佳的酶切反应温度，也有一些酶是低温活性更好，有的是28度
【酶切问题讨论专栏】
【酶切问题讨论专栏】
如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！
1.PCR产物的酶切。
PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:
PCR产物的酶切相关的帖子：
2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：
（1）酶切缓冲液。
每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。
在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：
（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见公司网站，如NEB提供了很好的buffer参数:
（B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？
分两次酶切。
即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。
一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大；
（C）克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。
（2）酶切温度。
酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如SmaⅠ为30度。
双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。
（3）酶切时间。
酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。
（4）酶失活。
如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。
这种情况较少见，只能换新酶。
如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？
放心，可以用不同公司的酶进行双酶切，一般不会有问题的。
可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！
（5）酶切体系。
选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。
相关帖子
关于保护碱基的资料:
CleaageClosetotheEndofDNAFragment1.doc（104.5k）
wangjun2002274的工作非常出色，建议加分，值得学习!
支持
请问前辈：
为什么双酶切时要先切低温再切高温？
如果酶切过夜会影响酶切效果吗？
主要是考虑到酶活性的维持。
温度对酶的活性影响很大，温度高，容易造成某些酶的失活；双酶切时，由于有2种的限制酶存在，2种酶可能有不同的最适反应温点，当1种酶在其最适温点反应时，为了不使另1种酶降解或失活，所以双酶切时要先切低温再切高温。
请问PCR产物酶切过夜，对连接没影响吗？
紧急求助！
万分感谢构建ector3个月没结果！
我的载体是PstI单酶切，脱磷。
目的片段是PCR产物切胶回收PstI单酶切（切2.5h,引物设计加6个保护碱基）,，然后又切胶回收，再连接，阴性对照长一些兰斑（可能脱磷不彻底），但样品只长几个白斑，鉴定全是假的。
请问高手问题出在哪？
是不是目的片段没切动导致没连上？
载体是pCAMBIA1300,目的片段9.7kb。
你的目的片段9.7kb,有点大,胶连有点困难了.可以考虑液连.用Agrose酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.
还有就是你的PCR产物PstI单酶切的问题,因为你跑胶看不出酶切的效果.可用一有PstI酶切位点的环质做对照一起酶切,可以看出部分问题.
你的载体脱磷也确实是个麻烦,每次做阴性对照也很对,但脱磷的程度要看你自己的掌握了,脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP一定要保证活性.最好用新的.
非常谢谢biotin,我再试试。
我个人认为，一般不到万不得已，没必要先回收再酶切，损失太大，绝大多数双酶切可在1×通用buffer中先切1小时，再在2×通用buffer中切1小时，可解决绝大多数酶切问题。
不过先回收，也能保证酶切的效率，如果PCR的产物量满意的话，回收的损失可以忽略不计。
毕竟酶切的效率对于克隆化相对更重要一些。
过去，早期的内切酶有星活性，过度酶切能给产物切的七零八落，现在好像已经没有这个问题了，早些年曾经遇到过把产物切碎了的情况。
是不是引物上加酶切位点的才需要保护碱基？
我的酶切位点都在PCR产物内部包含，还需要在引物上加保护碱基么？
不需要的，连接到T载体上直接就可以酶切鉴定！
我的PCR产物的酶切位点XbaI的保护性碱基是CG,HbaI也是CG，会影响我的酶切吗，我十分担心，高手能指点一下吗
我的质粒是pcdna3.1+cfp-c1,6000多bp！
有一个not1的酶切位点，我酶切了很多次都没有成功？
酶切都是2条带。
我用50ul体系，加了15ul的质粒（100ng/ul），2ul的酶，发应了10个小时还没有切动。
请高手指点，谢谢了！
wangjun2002274wrote:
不需要的，连接到T载体上直接就可以酶切鉴定！
:
）谢谢，小女子初涉江湖很多问题不懂，
在这里可以学得到很多好东东，
谢谢！
我现在双酶切一个T载体连接产物,用的是和EcoRI,先用BamHI30度切5小时,之后沉淀线性DNA,方法是:
加入1/10体积的乙酸钠和风细雨2.5体积的无水乙醇,18000转15分钟离心,再加入70%乙醇15000转离心10分钟,最后等乙醇挥发干净了再加入EcoRI的酶切体系37度切5小时.可是结果总是不对.本应该是2000和3000两条带,可是总是出现不正确的带,或者根本就乱七八糟,怎么回事啊?
请大家帮帮忙!
另外我还要双酶切pcDNA3.1,但是因为也是用的BamHI和EcoRI,所以切下来与没切开的片段相差只有几十bp,电泳根本看不出来,那我如何才能判断出来到底有没有切下来呢?
难道只能等连接上了才知道吗?
1）你首先要确定片段是否已经连接到T载体上；EcoRI和BamHI有共有的buffer，就用BamHI的自带buffer试一下。
2）确定BamHI和EcoRI的酶切效率，你可以找一个其它的单酶切位点，和BamHI或EcoRI双酶切，注意切下来的片段最好能达到400bp左右，酶切总体积可以加大些！
我其实这三个月一直在这上面打转，酶切，连接，转化。
我把我的问题与经验提供出来，一则借鉴，再则希望那位高手指点一下。
我是把目的基因与T-ECTOR连接后再进行酶切，这样做酶切效果好，而且也方便，你还可以不用加保护碱基，有时连酶切位点也不用加，直接用T-ECTOR上的。
每切的好坏与你提的质粒有关，如切不动，可以在提的时候多洗几次。
切碎则与盐有关。
时间一般在4小时之内，时间过长会出现乱切，下一步连不上。
一般情况下，4小时切不动，再长也不行。
我的烦恼是，我的双切载体与目的基因都很好，单带，很清晰。
转化过程也反复验证没有问题，但就是得不到阳性转化子，问题集中在切胶回收，连接这几步。
请高手指点迷津，切磋一下。
得不到阳性转化子，我想应该分析：
1）胶回收。
为了获得较多的酶切产物，应该扩大酶切体积，回收最好取几3ul电泳，以检测回收效率如何，也可以用分光光度计测定回收产物浓度，洗脱时取少量的水可以浓缩产物。
2）连接问题。
连接我一般10-15ul的反应体积，载体和PCR产物摩尔比一般为1：
1-1：
3，T4dnaligase很重要，连接的同时做一个阳性对照以检测连接效率。
连接最好16度水浴连接过夜。
3）感受态的问题。
转化之前要保证感受态细胞的转化效率较高，如果你能得到20个左右的转化子已经足够了。
自制感受态一定要用pUC18/19检测转化效率。
4）抗性平板问题。
AMP的浓度50-100ug/ml都行，最好用新制备的平板，LB的高压时间不要太久，15min足够，以免破坏培养基的营养。
新英格兰公司提供的：
双酶切buffer的选择
注：
U
SuppliedwithitsownuniquereactionbufferthatisdifferentfromthefourstandardNEBuffers.ItscompatibilitywiththefourstandardNEBuffersisindicatedbythechart.
BSA
Suppliedwithaseparateialofboineserumalbumin（10mg/ml）.Toobtain100%actiityBSAshouldbeaddedtothe1Xreactionmixtoafinalconcentrationof100µg/ml.
SAM
SuppliedwithaseparateialofS-adenosyl-methionine（SAM）.Toobtain100%actiity,SAMshouldbeaddedtothe1Xreactionmixasspecifiedontheproductdatacard.
dd
Whenperformingadoubledigestwiththisenzyme,thisNEBufferisrecommendedbecauseitminimizesstaractiity.
*
PurifiedbyscientistsatSibEnzymeandsuppliedwithaSibEnzymebuffer（B,K,O,WorY）whichensures100%actiity.ItscompatibilitywiththeNEBufferSystemisindicatedonthechart
NR
Thisbufferisnotrecommendedforusewithwiththisenzyme
BufferCompositions
（1X）:
NEBuffer1（yellow）:
10mMBisTrisPropane-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT（pH7.0at25°C）.NEBuffer2（blue）:
10mMTris-HCl,10mMMgCl2,50mMNaCl,1mMDTT（pH7.9at25°C）.NEBuffer3（red）:
50mMTris-HCl,10mMMgCl2,100mMNaCl,1mMDTT（pH7.9at25°C）.NEBuffer4（green）:
20mMTris-acetate,10mMmagnesiumacetate,50mMpotassiumacetate,1mMDTT（pH7.9at25°C）.
DetaiLedinformation：
得不到阳性转化子，我想应该分析：
1）胶回收。
为了获得较多的酶切产物，应该扩大酶切体积，回收最好取几3ul电泳，以检测回收效率如何，也可以用分光光度计测定回收产物浓度，洗脱时取少量的水可以浓缩产物。
2）连接问题。
连接我一般10-15ul的反应体积，载体和PCR产物摩尔比一般为1：
1-1：
3，T4dnaligase很重要，连接的同时做一个阳性对照以检测连接效率。
连接最好16度水浴连接过夜。
3）感受态的问题。
转化之前要保证感受态细胞的转化效率较高，如果你能得到20个左右的转化子已经足够了。
自制感受态一定要用pUC18/19检测转化效率。
4）抗性平板问题。
AMP的浓度50-100ug/ml都行，最好用新制备的平板，LB的高压时间不要太久，15min足够，以免破坏培养基的营养。
谢谢你的建议，是的我也考虑了这几点。
（1）胶回收，由于酶切是上1下5，在回收时是否会断裂，加热60-70度是否影响。
（2）连接，第一，在分子克隆上提到，若连接困难，可能末段封闭，因此建议连接之前45度保温5分钟。
这一步是否必要。
第二，体系（10ul），我一般是凭感觉，若回收的载体中度量（5微生）目的片段微弱，比例如何好。
第三，连接酶。
我不知到有多长时间了。
对照我是否可以用单酶切看连接效果。
（3）感说态是自己制的，用载体直接转过，没问题。
（4）平板经常出问题，有时不长，有时长的不是转化子，问题在于到平板时不能太凉，结果抗生素没混匀。
另外，还有一个情况，我前面在做T载体转化时，也是转不出来，是一个老师转的。
情况与此差不多。
综合这些情况，再请教以下？
多劳驾了。
（1）按说明书做，应该不会断裂！
（2）连接与末段封闭关系不大，主要在于两片段的比例及连接酶质量，回收的载体少，你只能再加大酶切量回收，跑电泳太浪费，测定浓度比较省事。
（3）T载体转化关键的还是上面提到的那几个，重提一句，酶很关键。
祝成功！
谢谢，若成功我回首先通知你。
我来了三次了，可是每次的问题都没有高手指点啊，主任能帮帮我吗？
好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶，HpaI和XbaI，但我PCR产物的保护性碱基是CG，会影响酶切吗？
电泳显示质粒酶切后跑慢了，连接后转化，试验组（和目的片断连接的质粒）和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。
密度还差不多，是否说明我酶切不好？
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？
还是一定要做T载体连接？
我来了三次了，可是每次的问题都没有高手指点啊，主任能帮帮我吗？
好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶，HpaI和XbaI，但我PCR产物的保护性碱基是CG，会影响酶切吗？
电泳显示质粒酶切后跑慢了，连接后转化，试验组（和目的片断连接的质粒）和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。
密度还差不多，是否说明我酶切不好？
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？
还是一定要做T载体连接？
EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。
用的是NEB的美和Buffer。
双酶切时应该用EcoRI的buffer.
我现在遇到的一个问题是：
ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体后测序发现，我当初引物设计时加上的一个ＥｃｏｒＩ的酶切位点不见了，末端少了 两个碱基，ＧＡ。
我用的酶是生工的Ｔａｑ ｐｌｕｓ， 最初我坚信是引物的问题，可后来我看到Ｔａｑ酶有５‘－３’外切酶活性，不知是不是在ＰＣＲ 是引物的‘５’端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消失。
恳请大虾指点迷津。
lanruowrote:
我来了三次了，可是每次的问题都没有高手指点啊，主任能帮帮我吗？
好郁闷啊。
1、我用的是MBI的内切酶，HpaI和XbaI，但我PCR产物的保护性碱基是CG，会影响酶切吗？
电泳显示质粒酶切后跑慢了，连接后转化，试验组（和目的片断连接的质粒）和只用酶切过的质粒做的对照都在平板上生长了。
密度还差不多，是否说明我酶切不好？
2、用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序吗？
还是一定要做T载体连接？
1）MBI的内切酶还可以，XbaI用过，酶切效率不高，酶切过的质粒做的对照也有转化子，我想肯定没有切完全或酶切后没有胶回收。
2）用自己的质粒连接的转化产物可以送出测序，并不是一定要做TA克隆，PCR产物酶切后可以直接连接到你的载体上。
wolfdancewrote:
EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。
用的是NEB的美和Buffer。
双酶切时应该用EcoRI的buffer.
我现在遇到的一个问题是：
ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体后测序发现，我当初引物设计时加上的一个ＥｃｏｒＩ的酶切位点不见了，末端少了 两个碱基，ＧＡ。
我用的酶是生工的Ｔａｑ ｐｌｕｓ， 最初我坚信是引物的问题，可后来我看到Ｔａｑ酶有５‘－３’外切酶活性，不知是不是在ＰＣＲ 是引物的‘５’端被切掉了两个碱基，导致了酶切位点的消失。
恳请大虾指点迷津。
我想你的猜测有道理，Ｔａｑ ｐｌｕｓ的保真效率高，适合长片段（10-30kb）扩增，公司的说明书上有这样的描述：
（1）highfidelitywithanerrorfrequency1.6/106（or0.0016/103）duringDNAsynthesis.
（2）TaqPlusincreasestheefficiencyofpolymerizationreaction,resultinginagreatpercentageofextenuationreactioncomplctionupto10kbto30kb.Pfuhasatemperatureoptimumbetween72-78℃andremains>95%actiefollowing1-hourincubationat95℃.
５’端碱基可能与你的酶有关系，最好换其它的酶，如果你要扩增长片段的DNA，可以试一试Takara的TaqEx。
不过高保真与外切酶活性是一个矛盾。
我查了一下，还没有说Ｔａｑ酶能切掉引物５’端碱基的报道。
不知主任是否遇到过这种情况。
我想该用Ｐｆｕ， 但他不能直接用于ＴＡ克隆。
我的片段有１４００ｂｐ， 测序后除了引物上有三个碱基错误（两个缺失， 一个错配）外，只有一个碱基与GENEbank不一样。
老板让我在重复一次，说不准就没有错误了因为错配饰随机的。
。
不知这种可能性大不大。
谢谢主任的回答
wolfdancewrote:
EcoRI和BamHI是能够同时进行酶切的，我做过，效果很好。
用的是NEB的美和Buffer。
双酶切时应该用EcoRI的buffer.
我现在遇到的一个问题是：
ＰＣＲ产物连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体后测序发现，我当初引物设计时加上的一个ＥｃｏｒＩ的酶切位点不见了，末端少了 两个碱基，ＧＡ。
我用的酶是生工的Ｔａｑ ｐｌｕｓ， 最初我坚信是引物的问题，可后来我看到Ｔａｑ酶有５‘－３’外切酶活性，不知是不是在ＰＣＲ 是引物的‘５’端被切掉
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