前6章分子.docx

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前6章分子

绪论

一、分子生物学研究范畴

生命科学是研究生命现象和生命活动规律的一门综合性学科。

生命科学的研究内容：

生命物质的结构与功能，生物与生物之间及生物与环境之间相互关系。

生命科学的前沿领域：

分子生物学、细胞生物学、发育生物学和神经生物学，而分子生物学是生命科学的核心前沿。

分子生物学——从分子水平研究生命现象及其规律的一门新兴学科。

它是生命科学中发展最快并且与其他学科广泛交叉和渗透的前沿领域。

三、分子生物学研究内容及研究现状

分子生物学的主要研究内容

生物大分子的结构、功能，生物大分子之间的相互作用及其与疾病发生、发展的关系。

（一）核酸分子生物学：

核酸的分子生物学主要研究核酸的结构及其功能。

核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此形成了分子遗传学。

分子遗传学：

形成了比较完整的理论体系和研究技术，它是目前分子生物学中内容最丰富、研究最活跃的一个领域。

2.核酸功能研究的重大进展

1944年，Avery等首次证明肺炎双球菌的DNA与其转化和遗传有关。

1952年，Hershey和Chase用35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌。

在大肠杆菌细胞内增殖的噬菌体中都只含有32P而不含35S,这表明噬菌体的增殖直接取决于DNA而不是蛋白质。

3.基因的人工合成

1978年体外首次成功地人工合成第一个完整基因。

直接证实了Mendel在1865年发现的遗传因子（基因）的化学本质，就是DNA分子。

DNA分子是多种多样生命现象的物质基础。

4.基因组研究的进展

基因组（genome）:

一个物种遗传信息的总和。

基因结构与功能研究已经从单个基因发展到生物体整个基因组。

基因组研究已从简单的低等生物到真核生物，从多细胞生物到人类。

5.基因表达调控机制的研究

1961年，Jacob和Monod提出操纵子学说，认识了原核生物基因表达调控的一些规律（1965年NobelPrize）。

80年代开始，人们逐步认识到真核基因组结构和调控的复杂性。

真核基因的顺式调控元件与反式作用因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用。

RNAi（小分子反义RNA，2006年NobelPrize）、

核酶、siRNA等。

（二）蛋白质分子生物学：

DNA→储存生命活动的各种信息。

蛋白质→生命活动的执行者。

蛋白质的分子生物学主要研究蛋白质的结构与功能。

三）细胞信号转导机制研究

构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其他各种生物学功能，均依赖于外界环境所产生的各种信号。

在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号通过第二信使转变成一系列的生物化学变化。

分子生物学：

是研究核酸等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。

思考题

生物大分子之间的相互作用是生命现象的具体表现。

请以生物大分子之间的相互作用（如蛋白质与蛋白质分子间，以及蛋白质与核酸分子间的相互作用）为例加以说明（从DNA复制、转录、翻译及基因表达调控等方面进行思考）。

第一章基因、基因组和基因组学

基因组（genome）

●单倍体细胞中所含的整套染色体（1922年）

●细胞或生物体中所有的DNA，包括所有的基因和基因间隔区域（最新概念）

Genomeinprokaryotes

●细菌染色体（chromosome）质粒（plasmid）

Genomeineukaryotes

●C值矛盾重复序列染色体和染色质

●细胞器基因组（线粒体基因组、叶绿体基因组）

C值矛盾（Cvalueparadox）

●一个单倍体基因组的全部DNA含量称为C值。

●生物体的结构和功能越复杂，其C值越大。

●生物体的复杂性与DNA含量之间并不总是正相关。

●与预期编码的蛋白质基因数量相比，基因组DNA含量过多；

●一些物种之间的复杂性变化范围并不大，但C值却有很大变化。

1、原核生物基因组结构特点

基因组很小，大多只有一条染色体，结构简炼，存在转录单元（transcriptionaloperon）

多顺反子（polycistron），有重叠基因（Sanger发现）

2、真核生物基因组结构特点

真核基因组结构庞大3×109bp、染色质、核膜

单顺反子

基因不连续性断裂基因（interruptedgene）、内含子（intron）、外显子（exon）

非编码区较多多于编码序列（9:

1）

含有大量重复序列（高度重复与中度重复序列）

三个阶段

●20世纪50年代以前

Ø细胞的染色体水平研究基因（基因的染色体遗传学阶段）

●50年代以后

Ø从DNA大分子水平研究基因（基因的分子生物学阶段）

●最近20多年来

Ø直接从克隆基因出发（基因的反向生物学阶段）

孟德尔的遗传因子假说（HypothesisoftheinheritedfactorMendel1866）

生物性状由遗传因子控制

亲代传给子代的是遗传因子（A,a….）

遗传因子在体细胞内成双（AA,aa），在生殖细胞内为单（A,a）

杂合子体细胞内具有成双的遗传因子（Aa）

等位的遗传因子独立分离，非等位遗传因子间自由组合地分配到配子中

●TheLawofDominance●TheLawofSegregation

●TheLawofIndependent　Assortment

TheoryoftheGene（ThomasHuntMorgan1926）

DNA分子双螺旋结构模型------1953年WastonandCrick　1962年获诺贝尔生理学医学奖

基因表达调控模型--------1961年JacobandMonod提出基因调控研究模型

中心法则----------1966年Crick提出中心法则

基因：

是编码功能性蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列），负载特定的遗传信息并在一定条件下调节、表达遗传信息，指导蛋白质合成。

一个基因包括编码蛋白质多肽链或RNA的序列、为保证转录所必需的调控序列、内含子及相应编码区上游5’端和下游3’端的非编码序列。

二、基因概念扩展

1、跳跃基因（转座因子、转座元件、移动基因）

（Jumpinggene/Transposableelement/movablegene）

2、间隔基因（splittinggene）

真核生物的结构基因是由若干exon和intron相间隔排列的序列组成的间隔基因

真核生物基因又称为Splittinggene间隔基因，Interruptedgene断裂基因

真核生物基因的转录物又称为

PrecursormRNA（pre-mRNA）前体mRNA

HeterogeneousnuclearRNA（HnRNA）核内不均一RNA

外显子（Exon）：

isanysegmentofaninterruptedgenethatisrepresentedinthematureRNAproduct。

DNA与成熟RNA间的对应区域，

氨基酸的编码区（aminoacidcodingregion），

非间隔区（unspacer）

Intron（内含子）

isasegmentofDNAthatistranscribed,butremovedfromwithinthetranscriptbysplicingtogetherthesequences（exons）oneithersideofit.

DNA与成熟RNA间的非对应区域

氨基酸的非编码区（uncodingregion）

间隔区（spacer）

3、真核生物的假基因（pseudogene）

a）概念：

与正常基因结构相似，但丧失正常功能的DNA序列，往往存在于真核生物的多基因家族中。

b）种类：

①功能基因累积突变型：

（非洲爪蟾5srDNAfamily）

②加工的假基因（processedpseudogene）

基因组中与RNA转录物相似的失活基因

无启动子和内含子，3’有一段连续的腺嘌呤短序列

4、重叠基因/嵌套基因（overlappinggene/nestedgene）

完全包含，末端重叠

重叠基因的种类

I类：

反向重叠基因（重叠基因分布在同一DNA区域的不同单链上）

II类：

同向重叠基因（重叠基因分布在同一DNA区域的同一单链上）

三、基因的种类和结构

★transcribed,translatablegene--structuregene（lacZ,Y,A）

★transcribedbutnon-translatablegene--RNAgene（tDNA,rDNA）

★non-transcribed,non-translatablegene--regulatorgene（promoter,operator）

基因家族与基因簇

Genefamily：

真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因（有转录产物）。

✓成簇存在，广泛分布

重复序列（无转录产物）

除了基因家族外，染色体上还有大量无转录活性的DNA序列家族，主要是基因以外的DNA序列。

a）串联重复序列

b）  散布重复序列（interspersedrepetitivesequence）

以散在形式分布于基因组内的散在重复序列

长散布元件（longinterspersedelement,LINE）

短散布元件（shortinterspersedelement,SINE）

第二章DNA的分子结构

一、DNA的一级结构

1、概念：

指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，DNA序列是这一概念的简称。

2、特征：

双链反向平行配对而成，脱氧核糖和磷酸交替连接，构成DNA骨架，碱基排在内侧，内侧碱基通过氢键互补形成碱基对（A：

T，C：

G）。

二、DNA的二级结构

1、定义：

指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。

DNA双螺旋表面上出现的螺旋槽（沟），宽的沟称为大沟，窄沟称为小沟。

大沟、小沟都是由于碱基对堆积和糖-磷酸骨架扭转造成的。

思考题：

DNA分子结构中的大沟与小沟有什么生物学意义？

2、分类：

右手螺旋：

A-DNA，B-DNA

左手螺旋：

Z-DNA

三股螺旋DNA（TribleHelixDNA,T.SDNA）

三、DNA的高级结构

线状DNA形成的超螺旋

环状DNA形成的超螺旋

不同二级结构形态及其电泳速度

第三章DNA的复制与修复

一、DNA的复制

（一）DNA的半保留复制（semi-conservativereplication）

1、定义：

由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。

2、实验证据（1958Meselson和Stahl）：

E.coli生长在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中，连续培养12代，使所有的DNA分

子都标记上了15N

3、DNA半保留复制的生物学意义：

DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。

（二）与DNA复制有关的物质

1、原料：

四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

2、模板：

以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA

3、引物：

DNA的合成需要一段RNA链作为引物

4、引物合成酶（引发酶）：

此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer）。

实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。

5、DNA聚合酶:

以DNA为模板的DNA合成酶

●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物●反应需要有模板的指导

●反应需要有3-OH存在●DNA链的合成方向为53

原核生物中的DNA聚合酶（大肠杆菌）

性质

聚合酶Ⅰ

聚合酶Ⅱ

聚合酶Ⅲ

3'5'外切活性

+

+

+

5'3'外切活性

+

-

-

5'3'聚合活性

+中

+很低

+很高

新生链合成

-

-

+

聚合酶Ⅰ：

主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。

聚合酶Ⅱ：

修复紫外光引起的DNA损伤

聚合酶Ⅲ：

DNA复制的主要聚合酶，还具有3'5‘外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性

6、DNA连接酶（1967年发现）：

若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。

但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来，DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用。

7、DNA拓扑异构酶（DNATopisomerase）：

拓扑异构酶І：

使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。

主要集中在活性转录区，同转录有关。

例：

大肠杆菌中的ε蛋白

拓扑异构酶ІІ：

该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。

同复制有关。

例：

大肠杆菌中的DNA旋转酶

8、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase）

通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。

E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。

蛋白沿3'5’移动，而解螺旋酶I、II、III沿5’3’移动。

9、单链结合蛋白（SSBP:

single-strandbindingprotein）：

稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。

（三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例）

1、双链的解开

复制原点：

DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。

ori（或o）、富含A、T的区段。

复制子：

从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子

复制叉：

复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉

双链解开、复制起始

DnaA蛋白识别起点序列,在起点特异位置解开双链，大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合，在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链，解链酶六聚体分别与单链DNA相结合（需DnaC帮助）,进一步解开DNA双链

2、RNA引物的合成

DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。

引物长度约为几个至10个核苷酸

3、DNA链的延伸

DNA的半不连续复制（semi-discontinuousreplication）：

DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。

前导链：

在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；

滞后链：

合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。

4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）

在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链

（四）真核生物中DNA的复制特点

1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子

2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制（多复制叉）。

真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。

3、真核生物有多种DNA聚合酶。

二、DNA的修复

DNA修复系统

功能

错配修复

错配发生之后的修复

碱基切除修复

切除突变的碱基

核苷酸切除修复

修复被破坏的DNA

DNA直接修复

修复嘧啶二体或甲基化DNA

1、错配修复

DNA错配修复缺陷导致遗传性非息肉结肠直肠癌发生，具有遗传性

●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺苷酸甲基化（m6A甲基化酶）

●甲基化紧随在DNA复制之后进行

●根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基

甲基化的作用是帮助修复酶系识别母链及新合成的子链

2、碱基切除修复

一些碱基在自发或诱变状态下会发生脱氨基，然后改变配对性质，造成碱基转换突变

●腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对

●鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对

●胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对

3、核苷酸切除修复

1）通过特异的核酸内切酶识别损伤部位

2）由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸

3）DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链

4）DNA连接酶将切口补平

4、DNA的直接修复

在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二聚体和6-4光化物还原成为单体

烷化剂使碱基烷基化，能改变碱基配对的性质。

甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤，防止G-T配对

5、重组修复

●在重组修复过程中，DNA链中的损伤并未除去

●当进行下一轮的复制时，留在母链上的损伤仍然会给复制带来困难，依然需要上述过程进行修复

●随着复制的不断进行，即使损伤未除去，但由于在后代中已经被稀释，实际上已经消除了损伤的影响，达到修复目的。

6、易错修复与SOS反应

易错修复（应急条件下产生的DNA聚合酶IV、V无校正功能）

易错修复允许错配可增加存活的机会，同时也带来了高变异率

第四章DNA重组

什么叫DNA重组（DNArecombination）？

DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，即核苷酸序列的交换、重排（rearrangement）和转移现象，称为DNA重组。

重组产物称为重组体DNA。

DNA重组的广泛性

广泛存在于各类生物。

真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。

细菌及噬菌体来自不同亲代两组DNA之间可通过多种形式进行遗传重组。

DNA重组的生物学意义

●迅速增加群体的遗传多样性

●通过优化组合积累有意义的遗传信息

●还参与许多重要的生物学过程

为DNA损伤或复制障碍提供修复机制---重组修复

某些生物的基因表达受DNA重组调节

DNA重组在相应序列之间精确发生，所以在重组染色体上既不会多加也不丢失任何碱基。

重组可分为三种类型，其共同点是在两个DNA双链之间发生物理性物质交换，但不同类型发生的机制却不相同。

DNA重组机制

一、同源重组（homologousrecombination）

●一般性重组（generalrecombination）

●是在两个DNA分子的同源序列间直接进行交换的一种重组形式。

●真核生物中，同源重组发生在减数分裂时期

●细菌的接合、转化、转导

1Holliday模型RobinHolliday于1964年提出

拼接重组体：

重组体含有一段异源双链区，其两侧来自不同本，称为拼接重组体。

片段重组体：

重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本，称为片段重组体。

DNA在分支点带有一些单链的十字形Holliday中间体

Holliday模型形成小结

●1重组始于双链断裂（两条同源序列先整齐排列）两个配对双链DNA的同源链中相应位点发生断裂

●2通过分支迁移产生异源双链重组结合点能够沿双链移动

●3形成Holliday中间体

●4Holliday中间体切开并修复，切口方向决定重组结果

形成片段重组体（前后两个切口在同一条链上）

或拼接重组体（前后两个切口在不同链上）

同源重组双链之间进行连接所需要的同源区域最短是多少？

通过质粒及噬菌体把短的同源序列引入细菌的实验表明，如果同源区小于75bp则重组频率降低。

2大肠杆菌重组的分子基础

●在细菌中识别重组位点

●重组仅涉及DNA分子的限定区域而不是完整的染色体

●重组的一般过程是相同的：

1）两条序列先平行排列，然后两条序列的其中一条单链均发生断裂

2）断裂分子的一个单链与其同源双链相互作用

3）配对区域延伸-----分支迁移

4）内切核酸酶消化同源双链

●每一步都需要酶的催化

●重组（Recombination）有关的酶

RecA蛋白及其功能

在E.coli中，RecA蛋白参与重组是最关键的步骤

1诱发SOS反应－－作为共蛋白酶（co-protease）促进LexA蛋白和UmuD的自水解；是SOS反应最初发动的因子

2促进DNA单链的同化－－单链同化即指单链与同源双链分子发生链交换，从而产生重组过程中的DNA配对、Holliday中间体形成、分支迁移等步骤。

RecA蛋白诱发SOS反应

严重的DNA损伤产生大量单链缺口-----激活RecA蛋白（需要单链DNA和ATP存在）

------LexA阻遏蛋白裂解，阻遏作用解除-------一系列基因表达（包括修复基因）

-------DNASOS修复（易错修复，突变增加）

RecA蛋白介导的DNA链交换模型（单链同化）

RecA蛋白与单链DNA结合RecA蛋白与单链DNA的结合具有协同性

复合物与同源双链DNA结合入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换

RecBCD系统及其功能

1任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进行链交换。

2单链DNA可由多种途径产生。

3RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链的主要途径，产生3’单链末端。

该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。

具有三种酶的活性

1依赖于ATP的核酸外切酶活性

2可被ATP增强的核酸内切酶活性

3ATP依赖的解螺旋酶活性

Χ序列及其功能

Ø是一段特殊的碱基序列，其一致序列是

5’-GCTGGTGG

Ø它的存在能显著提高重组的频率

Ø在重组中的作用是调节RecBCD的酶活性

Ø作为其从3’-外切酶活性转变为5’-外切酶活性的信号

RuvA、RuvB和RuvC蛋白

●RuvA蛋白识别Holliday连接，协助RuvB蛋白催化分支的迁移。

以一种特别的方式形成四聚体，呈四重对称。

●RuvB蛋白是一种解链酶，催化重组中分支的迁移，是一种环状六聚体蛋白。

单独结合DNA的效率并不高，需要RuvA的帮助。

●RuvC蛋白是一种特殊的核酸内切酶，在重组中促进Holliday连接的分离，又称拆分酶，是一种二聚体蛋白。

其作用具有一定的序列特异性，其作用的一致序列为5’-（A/T）TT（G/C）-3’

二、位点特异性（专一性）重组（site-specificrecombination）

Ø指发生在DNA特异性位点上的重组

Ø参与重组的特异性位点需要专门的蛋白质识别和结合

Øλ噬菌体在E.coli细胞中以两种形式存在：

裂解状态与溶原状态（前噬菌体）

Ø两种类型间的转换通过位点特异性重组实现

　为了进入溶原状态，游离λDNA必须整合到宿主DNA中（整合反应）；为了从溶原状态进入裂解周期，前噬菌体DNA必须从染色体DNA上切除下来（切除反应）。

（一）λDNA通过位点特异性重组机制整合和