新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响.docx
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新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响
新型人趋化素样因子超家族8对人白血病细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响
【摘要】 本研究探讨新型趋化因子CKLFSF8对人白血病HL60细胞的增殖和表皮生长因子受体表达的影响,应用RTPCR方法检测CKLFSF8基因在HL60细胞中的表达;利用脂质体将CKLFSF8基因转染到HL60细胞,在倒置显微镜下观察细胞生长;MTT法检测细胞的增殖程度;免疫细胞化学法检测CKLFSF8基因转染前后HL60细胞EGFR的表达。
结果表明:
在细胞生长过程中可检测到CKLFSF8表达;CKLFSF8基因转染前后HL60细胞的增殖受到了明显的抑制,与空白对照组和空质粒组相比有显着性差异;对比转染前后细胞EGFR表达的阳性率具有显着性差异。
结论:
CKLFSF8基因转染对白血病细胞HL60的增殖和EGFR的表达有明显抑制作用。
【关键词】CKLFSF8;HL60细胞;细胞增殖;EGFR
EffectsofNovelHumanChemokinelikeFactorSuperfamily8onProliferationandEGFRExpressionofHL60Cells
AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheeffectofchemokinelikefactorsuperfamily8(CKLFSF8)onproliferationandexpressionofepidermalgrowthfactorreceptor(EGFR)ofHL60cells.ExpressionofCKLFSF8mRNAonHL60celllinewasassayedbyRTPCR;thetargetgenewastransfectedintothecellsbylipidvector,cellproliferationwasdeterminedbyMTTassay,whileexpressionofEGFRinHL60wasdeterminedbyimmunocytochemicaltechnique.TheresultsindicatedthatexpressionofCKLFSF8existedinHL60cells.Aftertransfection,cellproliferationwasinhibited(P﹤)andtheexpressionofEGFRinHL60cellswasalsodiscoveredtobeinhibited(P﹤).ItisconcludedthattheproliferationandexpressionofEGFRinHL60cellscanbeinhibitedbytransfectionofCKLFSF8.Thenovelchemokinemayprovideanewapproachinthetreatmentofleukemia.
KeywordsCKLFSF8;HL60cell;cellproliferation;EGFR
趋化因子是一组具有趋化活性的小分子蛋白质,在炎症、肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应及AIDS的演化等过程中发挥重要作用[1]。
趋化素样因子超家族成员8(chemokinelikefactorsuperfamily,CKLFSF8)是新近发现的新型人类趋化因子。
研究发现,大多数细胞内都有该因子的表达,在肝脏、肺脏和胰腺细胞内高表达;CKLFSF8在某些肿瘤组织和肿瘤细胞中也有表达[2],但有关CKLFSF8对肿瘤细胞表皮生长因子影响的研究报道尚少。
为了探讨这种新的趋化因子在白血病的发生发展中的作用,我们选择白血病细胞株HL60为研究对象,观察新型细胞因子CKLFSF8对HL60的增殖和表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)表达的影响。
材料和方法
菌株和质粒
DH5α购自Gibco公司。
带有目的基因片段CKLFSF8的质粒和pEGFP由北京大学人类疾病基因研究中心马大龙教授惠赠。
人白血病限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ为TakaRa产品。
质粒提取试剂盒为Vegen产品。
RPMI1640及TRIZOLRNA提取试剂为Gibco产品。
RTPCR试剂为上海生物工程技术有限公司产品。
小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。
转染试剂LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。
山羊抗人EGFR抗体为SantaCruz公司产品。
免疫组织化学试剂盒为北京中杉生物技术有限公司产品。
HL60细胞的培养和RNA的提取
将HL60细胞接种于含100ml/L小牛血清的RPMI1640培养液,置37℃5%CO2培养箱中常规培养。
取生长旺盛的HL60细胞,按TRIZOL试剂盒说明书提取肿瘤细胞总RNA。
HL60细胞CKLFSF8的检测
采用RTPCR法,将HL60细胞总RNA进行反转录。
根据CKLFSF8mRNA序列设计引物,上游为3‘GCCTTCATGAGTCAAGGTCGT5‘,下游为5‘AGAGAGGTAGAAGACGAAGGC3‘。
PCR反应条件94℃7分钟,94℃30秒,59℃30秒,72℃40秒,72℃7分钟,共进行35个循环。
βactin做内对照。
10g/L琼脂糖凝胶电泳,观察扩增产物片段。
质粒扩增和鉴定
制备感受态细胞,用质粒-CKLFSF8进行转化,涂在含有氨苄青霉素的培养基上,37℃培养12小时,挑取单个菌落,37℃震摇培养3小时,按质粒提取试剂盒方法提取质粒。
将质粒分别进行EcoRⅠ单酶切和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切。
琼脂糖电泳鉴定获得的CKLFSF8基因片段。
CKLFSF8基因转染HL60细胞
按试剂盒使用说明书进行转染。
取1×106个处于对数生长期的HL60细胞,用无血清培养基洗2次,用500μl无血清培养基接种于6孔培养板,将2μg带有目的基因片段CKLFSF8的质粒与10μl脂质体混合后缓慢均匀加到细胞表面,孵育5小时后更换2倍血清浓度的完全培养液,培养24小时。
更换完全培养液,继续培养48小时收获细胞进行检测。
首先以带绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-CKLFSF8转染HL60细胞来检测转染率。
用荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白表达的情况,计数10个视野的细胞,取平均值作为转染率。
然后分别设未转染质粒的对照组、质粒对照组和-CKLFSF8质粒转染组。
HL60细胞增殖的检测
将200μl105个转染细胞和对照组细胞分别加入96孔细胞培养板,每组3个复孔,37℃5%CO2培养48小时,每孔加入MTT10μl,继续培养4小时。
小心吸出培养上清,每孔加入100μl二甲基亚砜,震荡溶解颗粒,用酶标检测仪测定A570值。
CKLFSF8基因转染HL60细胞前后EGFR表达的检测
采用免疫细胞化学方法检测。
HL60细胞做细胞滴片,用800ml/L丙酮固定10分钟,pH PBS冲洗,依次在标本片上滴加1∶500稀释的山羊抗人EGFR抗体,用PBS冲洗后,滴加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊二抗,DAB显色,光学显微镜下观察,阳性细胞是被染成棕色的细胞,各观察10个视野,计数200个细胞,计算EGFR阳性表达率。
阳性率=(阳性细胞数/细胞总数)×100%
统计学处理
实验所得数据用SPSS 软件进行t检验,用均数±标准差(±SD)表示。
结果
CKLFSF8基因在HL60细胞中的表达
白血病细胞株HL60总RNARTPCR结果显示,在100-250bp之间出现单一电泳带。
根据所设计引物和GeneBank中CKLFSF8mRNA的序列,扩增产物片段应为187bp,与电泳带符合。
这说明CKLFSF8基因在这种细胞中有表达。
Figure1.mRNAexpressionofCKLFSF8inHL60.Lane1:
β-actin.Lane2:
CKLFSF8fragment.M:
markerDL2000.
CKLFSF8质粒的酶切鉴定
质粒CKLFSF8经EcoRI单酶切得到该质粒的全长DNA片段,为6020bp。
经EcoRI和BamHI双酶切得到长度分别为5500bp和520bp两个DNA片段,其中520bp片段为CKLFSF8基因。
Figure2.RestrictiveanalysisoftherecombinantplasmidCKLFSF8Lane1:
CKLFSF8/EcoRI+BamHI.Lane2:
CKLFSF8/EcoRI.M:
DNAmarker.
CKLFSF8基因转染对HL60细胞增殖的影响
与空质粒对照组和空白对照组相比CKLFSF8质粒组A570值显着降低,而空质粒组和空白组无显着性差异。
这说明CKLFSF8对白血病细胞HL60有明显抑制作用。
Table.EffectofCKLFSF8onproliferationofHL60cells
GroupHL60CKLFSF8±**±*Control±*P﹥comparedwithcontrolgroup;**P﹤comparedwithcontrolgroupand
CKLFSF8基因转染对HL60EGFR表达的影响
荧光显微镜观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况,并且经过计算得出脂质体介导的HL60细胞的转染率是%。
CKLFSF8质粒转染HL60细胞前后EGFR表达的阳性率比较,转染前阳性率为%,转染后阳性率为%,差异具有统计学意义,说明CKLFSF8对HL60细胞的EGFR表达有抑制作用。
讨论
趋化因子是一组结构相似的小分子蛋白质,在蛋白质水平上含有4个保守的半胱氨酸,根据前2个半胱氨酸的相对位置不同,可分为CXC、CC、C和CX3C4个亚家族,C代表半胱氨酸,X代表任一氨基酸[3]。
北京大学人类疾病基因研究中心从人单核细胞的前体细胞株U937细胞中分离出一种新的细胞因子命名为趋化素样因子1(chemokinelikefactor1,CKLF1)[4],因其氨基酸序列中有3个半胱氨酸,最后2个连续排列,呈CC家族趋化因子的特征性结构,因此将其归为CC家族趋化因子[5]。
随后运用生物信息学的方法,又发现与CKLF1有同源性的其它8个基因,分别命名为趋化素样因子超家族成员1-8(chemokinelikefactorsuperfamily1-8,CKLFSF18)[6]。
其中,CKLFSF8基因位于第3号染色体,其cDNA全长1185bp,其中第295816位核苷酸编码173个氨基酸组成的CKLFSF8蛋白分子,该蛋白属CKLF1超家族成员,包括4个跨膜区和1个MARVEL结构域,该结构域与TM4SF结构相似,且CKLFSF8与TM4SF有%氨基酸相同[3]。
CKLFSF8分子有2个变异体,分别由173和115个氨基酸残基组成。
本实验就其中1个变异体即由173个氨基酸残基组成的趋化因子进行了研究。
在本实验中,利用含CKLFSF8的质粒转染HL60细胞,对转染前后细胞株中该因子的表达情况进行观察。
结果显示,HL60细胞能表达CKLFSF8,转染CKLFSF8后细胞内CKLFSF8过表达,细胞的增殖明显被抑制,与对照组相比有显着性差异。
表皮生长因子受体是一种位于细胞膜上的酪氨酸激酶受体,其编码基因又称erbB1。
EGFR与其配体结合后,通过自身磷酸化介导细胞内一系列的生长信号,促进细胞增殖。
同时EGFR还能促进肿瘤部位新生血管的形成,而促进肿瘤的生长和转移[7]。
人类的多种肿瘤细胞中也可见EGFR和其配体的高表达[8]。
临床研究显示,针对EGFR的药物和单克隆抗体能够抑制肿瘤细胞的增殖[9]。
因此,EGFR是与肿瘤生长明显相关的膜分子。
为探讨CKLFSF8转染后细胞的增殖被抑制的可能机制,我们研究了转染后细胞表面EGFR的表达,结果显示CKLFSF8质粒转染HL60细胞后EGFR表达明显降低,与对照组相比,有显着差异。
实验结果表明,趋化因子CKLFSF8基因可在HL60细胞株中表达,转染该基因后白血病细胞过表达这种趋化因子,且该基因对HL60细胞表面EGFR的表达有明显抑制作用,这提示CKLFSF8可能通过抑制HL60细胞EGFR的表达而达到抑制HL60细胞生长的作用。
目前对于这种新型趋化因子的结构已经有了比较深入的了解,但是对于它的功能研究很少,后续还需作许多体内外相关实验,比如趋化实验、动物实验等,以便对这种新型趋化因子有更全面深入的了解,为这种新型趋化因子的应用打下坚实的理论基础。
从对这种新型趋化因子的现有研究结果来看,有望对白血病的治疗提供新的思路。
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