转铁蛋白与RGD共修饰脂质体用于脑胶质瘤靶向性研究.docx
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转铁蛋白与RGD共修饰脂质体用于脑胶质瘤靶向性研究
转铁蛋白与RGD共修饰脂质体用于脑胶质瘤靶向性研究
邵云,俞向荣,吴一平,姚建社,羊正祥
(214023江苏无锡,无锡市人民医院神经外科)
[通信作者]邵云,E-mail:
[摘要]目的:
构建转铁蛋白与整合素受体RGD共修饰脂质体并对其脑胶质瘤靶向性进行初步研究。
方法:
采用薄膜分散法制备RGD修饰脂质体,采用后插入法制备转铁蛋白与RGD共修饰脂质体,观察其形态,粒径,电位。
并通过U87脑胶质瘤细胞摄取实验以及裸鼠脑组织离体成像实验考察脂质体的脑胶质瘤靶向性。
结果:
所制备的双配体脂质体粒径在(120±8.5)nm,电位为(-5±1.15)mV。
体外细胞摄取实验表明,U87脑胶质瘤细胞对共修饰脂质体的摄取效率分别是转铁蛋白修饰脂质体和RGD修饰脂质体的2.1倍和2.7倍。
肿瘤球摄取实验以及裸鼠脑组织离体成像实验表明共修饰脂质体具有良好的肿瘤靶向性以及脑部肿瘤传递能力。
结论:
转铁蛋白与RGD共修饰脂质体具有一定的脑胶质瘤靶向性,是一种潜在的脑胶质瘤给药系统。
[关键词]转铁蛋白;RGD;脂质体;脑胶质瘤
TransferrinandRGDco-modifiedliposomeforgliomatargeting
SHAOYun,YUXiang-rong,WUYi-ping,YAOJian-she,YANGZheng-xiang
(DepartmentofNeurosurgery,WuxiPeople'sHospital,Wuxi214023,China)
AbstractObjective:
TopreparetransferrinandRGDco-modifiedliposomeandevaluatetheirgliomatargetingefficiencyinvitroandinvivo.Methods:
Theco-modifiedliposomewaspreparedbyfilm-ultrasonicmethod.Theappearance,particlesize,Zetapotentialwereevaluated.ThecellularuptakebyU87cellsinvitroandvivoimagingwereusedtoevaluatethetargetingefficiency.Results:
Theparticlediameteroftheco-modifiedliposomewas120±8.5nmwiththeZetapotentialof-5±1.15mV.Theresultdemonstratedthattheco-modifiedliposomeuptakenbyU87were2.1,2.7timeshigherthanthatoftransferrinmodifiedliposomeandRGDmodifiedliposome,respectively.Theevaluationoftumorspheroidpenetrationandinvivoimagingshowtheco-modifiedliposomehasthestrongestfluorescenceintensity.Conclusion:
Theco-modifiedliposomemightserveasapromisinggliomadeliverysystemofantitumordrugs.
Keywords:
Transferrin;RGD;Liposome;Glioma
原发性中枢神经系统肿瘤的发病率不断增加,其中,神经胶质瘤占总发病数的77%~80%左右,是颅内最常见的恶性肿瘤[1]。
手术治疗是脑胶质瘤临床治疗的首选方案。
然而由于脑胶质瘤本身是侵润生长,不易与正常的脑组织区分,因此在手术过程中很难将肿瘤组织全部切除,为了杀伤肿瘤细胞还需要放射治疗和化疗。
然而化疗药物很难到达脑部肿瘤组织还会产生很大的副作用。
因此脑胶质瘤的治疗迫切需要新手段。
转铁蛋白受体是一种在正常细胞和肿瘤细胞表面都普遍存在的受体,但是在肿瘤细胞的表面(尤其是脑胶质瘤)转铁蛋白受体的表达是正常细胞的4~5倍[2]。
整合素(Integrins)是一类细胞黏附受体分子,在有核细胞表面均广泛表达,其中整合素αvβ3在神经胶质瘤、黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关的内皮细胞表面高度表达,与肿瘤的血管发生,肿瘤转移及肿瘤的抗放射治疗密切相关,因此整合素αvβ3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点。
已有研究表明,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的三肽序列能够特异性地识别含αv亚基的整合素家族,具有高度亲和力[3]。
脂质体是由磷脂组成的具有双层膜结构的球形结构。
能够在水相包载亲水性的药物,也能在脂质双层包载亲脂性的药物同时,脂质体可以很容易进行表面修饰,可以引入PEG延长循环时间,达到长循环的效果,也可以连接配体成为主动靶向脂质体。
本研究成功制备了转铁蛋白(TF)与RGD共修饰的脂质体,并对共修饰脂质体的靶向性进行了体内外评价。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂与仪器
SizerNanoZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪(英国MalverninstrumentsLtd)。
RGDpeptide(成都凯捷生物公司);大豆磷脂(SPC,上海太伟药业有限公司);DSPE-PEG2000(美国Avantipolarlipids公司);胆固醇(Cho,美国sigma公司);DMEM高糖培养基(美国GIBCO公司);转铁蛋白(美国sigma公司);香豆素-6(美国sigma公司);DSPE-PEG2000-MAL(美国sigma公司);其余试剂为分析纯。
人脑胶质瘤细胞(U87,上海细胞研究所)。
1.2方法
1.2.1RGD修饰脂质体的制备
参照文献[4]方法合成DEPE-PEG2000-RGD。
使用薄膜分散法制备RGD修饰脂质体。
将处方量的香豆素-6,SPC,Cho,DSPE-PEG2000-RGD,DSPE-PEG-OMe(保证总磷脂:
胆固醇=70:
30(molarratio),分别溶于氯仿,置50ml茄形瓶中旋转蒸发成膜后,再置真空干燥器中过夜。
加入2.5mLPBS缓冲液(pH7.4),置空气浴摇床中,37℃,180rpm,20min水化,水浴超声5min脱膜,探头超声(80W×5s×15次)制备得到RGD修饰的脂质体(RGD-LP)。
1.2.2转铁蛋白修饰脂质体的制备
转铁蛋白修饰脂质体(TF-LP)分五步进行。
第一步是采用同于“1.2.1”的方法制备普通脂质体。
第二步:
精密称取适量转铁蛋白,用巯基化反应液溶解并使其浓度为12mg·ml-1,精密称取适量Traut’sreagent同样以巯基化反应液溶解并使其浓度为2mg·ml-1。
将二者混合并使TF:
Traut’sreagent=1:
5(摩尔比),在微型振荡器中避光反应125rpm,25℃,1h,得到巯基化的转铁蛋白(TF-SH)。
将反应后得到的TF-SH溶液过G50葡聚糖凝胶柱(1×20cm)分离TF-SH和游离的Traut’sreagent。
第三步:
精密称取一定量Mal-DSPE-PEG2000溶于氯仿中,在茄形瓶中减压蒸馏成膜,除去有机溶剂,置于真空干燥器中过夜,使其充分干燥,加入适量PBS水化,制备Mal-DSPE-PEG2000胶束。
第四步:
将第二步制备好的TF-SH与第三步制备好的Mal-DSPE-PEG2000胶束按照一定比例混合(TF-SH:
Mal-DSPE-PEG2000=1:
10,摩尔比)在微型振荡器中避光反应125rpm,25℃,4h,使TF-SH中的-SH与Mal-DSPE-PEG2000中的Mal相结合,反应完后加入适量10mg·ml-1的2-MEA溶液(并使溶液中2-MEA最终浓度为1mM),继续反应30min,使2-MEA上-SH与TF-SH上-SH竞争性结合Mal-DSPE-PEG2000上的Mal,以反应掉剩余Mal-DSPE-PEG2000。
最终得到TF-Mal-PEG2000胶束。
第五步:
将第一步制备的普通脂质体与第四步得到的TF-Mal-PEG2000胶束按照脂质材料:
胶束=50:
1(摩尔比)比例混合后,微型振荡器中避光反应150rpm,37℃,1h。
反应后溶液过CL-4B琼脂糖凝胶柱(1×20cm)除去游离的TF-Mal-PEG2000胶束,得到转铁蛋白修饰的长循环脂质体。
1.2.3转铁蛋白与RGD共修饰脂质体的制备
取“1.2.1”项制备的RGD修饰脂质体与“1.2.2”项第四步制备的TF-Mal-PEG2000胶束按照“1.2.2”项第五步方法制备得到TF与RGD共修饰的脂质体(RGD/TF-LP)。
1.2.4共修饰脂质体的形态,粒径和Zeta电位
将共修饰的脂质体用磷钨酸染色,采用透射电镜(TEM)观察形态。
另取适量样品用粒度仪测定其粒径以及电位。
1.2.5不同脂质体体外细胞摄取实验
将U87细胞按每孔1×105个细胞接种于含10%血清24孔板中,培养24h后,在孔板中加入样品RGD-LP,TF-LP和RGD/TF-LP,每个孔加入100μL,于CO2培养箱中分别孵育2h,弃去培养基,加入适量PBS清洗3次,加入1mL1%triton-100裂解细胞,4℃避光裂解0.5h以上,待裂解完全后,取各组样品各200μL在Ex=465nm、Em=502nm用荧光分光光度计测定的荧光强度。
1.2.6U87脑胶质瘤细胞体外肿瘤球模型的构建以及对脂质体的摄取考察
取对数生长期的U87细胞用0.125%胰酶消化后,用含血清的培养基中和胰酶,并将细胞吹打下来后离心,弃去上清液用培养基重悬细胞后接种于用低熔点琼脂糖预处理的96孔板中,将96孔板移入37℃CO2孵箱中培养。
肿瘤球生长7天后,分别加入载香豆素-6的RGD-LP,TF-LP和RGD/TF-LP,加培养基调整脂质体的终浓度为120nmol.ml-1。
37℃孵育4h后,将细胞用PBS漂洗三次,加4%多聚甲醛固定15min,弃去多聚甲醛,用冰PBS保存。
置激光共聚焦荧光倒置显微镜观察肿瘤球摄取情况。
1.2.7裸鼠荷U87胶质瘤模型的建立以及裸鼠脑组织离体成像
U87细胞经胰酶消化,离心后将其悬浮于DMEM培养液中,计数调节浓度至5×107个/ml。
3只裸鼠(约25g,雌性)i.p.0.4g/kg水合氯醛麻醉,内毗连线与头部矢状中线交汇处纵向1cm长头皮切口,分离暴露颅骨,于前囱旁开3mm,向后1mm处颅骨钻孔。
微量注射器吸入10μl上述细胞悬液,固定于立体定位仪上,沿钻孔垂直进针深6mm(右侧大脑纹状体区),后退1mm注射U87细胞悬液10μl,留针5min,缓慢拔针,以生理盐水冲洗,切口用线缝合打结。
按照“1.2.1”、“1.2.2”和“1.2.3”项下方法制备载近红外荧光染料DIR的不同脂质体,荷瘤裸鼠尾静脉注射4h后,,将小鼠用10%水合氯醛麻醉,仰卧固定,经心脏灌流生理盐水及多聚甲醛后,取脑组织于荧光活体成像系统下观察并拍照(Ex=730,Em=790)。
1.3统计学方法
实验数据以均数±标准差表示,SPSS11.0统计软件进行数据分析,两组间比较用t检验,多组间比较用方差分析。
P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1不同脂质体的表征
共修饰脂质体的透射电镜扫描如图1所示,制备的脂质体成球状,形态均一。
粒径与电位结果如表1所示,不同脂质体的的粒径均小于200nm,PDI小于0.3,符合实验要求。
图1共修饰脂质体的透射电镜照片
表1不同脂质体的粒径与电位(n=3)
Formulation
Size/nm
PDI
Zeta-potential/mV
RGD-LP
123.8±7.5
0.230±0.030
-2.12±1.16
TF-LP
118.4±6.3
0.200±0.040
-5.82±3.13
RGD/TF-LP
129.8±5.5
0.180±0.080
-3.50±2.23
2.2不同脂质体体外细胞摄取情况
在U87脑胶质瘤细胞表面转铁蛋白受体与整合素受体高度表达。
不同脂质体的摄取实验结果如图2所示:
U87细胞对共修饰的脂质体的摄取效率分别是TF修饰的脂质体和RGD修饰脂质体的2.1倍和2.7倍。
由结果可见,共修饰后,RGD与转铁蛋白发挥协同作用,促进细胞摄取。
图2U87细胞对不同脂质体的摄取情况
2.3肿瘤球模型对脂质体的摄取情况
本实验采用体外肿瘤球模型来模拟脂质体进入体内后在肿瘤组织的摄取以及分布情况。
结果如图3所示,单独修饰RGD和TF的脂质体均能很好的进入肿瘤球内部,共修饰脂质体能够进入肿瘤球能力最强。
这是由于两种肿瘤细胞表面都高度表达的配体共修饰后,发挥协同作用。
图3U87肿瘤球对载香豆素-6脂质体的摄取实验
2.4荷瘤裸鼠原位肿瘤模型的建立及裸鼠脑组织离体成像
图4为荷瘤裸鼠脑组织近红外荧光成像。
可以直观的观察到,共修饰脂质体的脑部肿瘤组织蓄积最强。
图4载DIR的不同类型的脂质体在小鼠脑内的分布
3讨论
脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤。
尽管近年来,肿瘤疾病的治疗手段日趋丰富,技术越来越先进,但是原发性脑胶质瘤病人的生存期一直维持在15-22个月[5]。
研究新型脑胶质瘤的治疗手段显得十分迫切。
已经有研究证实,在脑胶质瘤细胞表面高度表达转铁蛋白受体以及整合素受体[6-7]。
转铁蛋白是一种小分子糖蛋白,它可以与肿瘤表面高度表达的转铁蛋白受体结合并在其介导下被细胞内吞入细胞内。
将转铁蛋白连接在载药脂质体上从而使脂质体具有一定的肿瘤靶向性,利用该方法来治疗肿瘤疾病已经被广泛的研究并且取得了初步的成效[8]。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)的三肽序列能够特异性地识别含αv亚基的整合素家族,进一步的研究也已证实,具环状结构的RGD能够显示出和整合素αvβ3、αvβ5的高度亲和力,其与整合素αvβ3的亲和力约为线性RGD的1000倍[9]。
因此,本研究将转铁蛋白和RGD两种特异性的配体连接到脂质体表面,提高了脂质体的对肿瘤细胞的选择性,特异性的靶向至脑胶质瘤细胞,利用两种特异性配体的选择性,一方面可以避免载药后对正常细胞的损伤,另一方面利用两种配体的协同作用介导高效入胞。
本研究研究结果显示,脑胶质瘤细胞对共修饰脂质体的摄取效率远远高于转铁蛋白脂质体和RGD脂质体。
这是由于脂质体通过EPR效应到达肿瘤组织后,再由脂质体表面的转铁蛋白和RGD分别与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体以及整合素受体的特异性结合,介导脂质体入胞。
转铁蛋白与RGD共修饰能够起到协同作用,促进脂质体被肿瘤细胞所摄取。
在某些实体肿瘤组织中,由于肿瘤组织致密生长,肿瘤内部压力高且血管少,因此给药系统很难进入肿瘤组织深部[10]。
本研究构建了体外脑胶质瘤肿瘤球模型用于评价共修饰对实体肿瘤的穿透效率。
结果显示,共修饰脂质体对肿瘤球具有良好的穿透性。
本研究中应用脑立体定位仪构建了裸鼠脑胶质瘤原位肿瘤模型,很好的实现了脂质体的靶向评价研究。
在小动物活体成像研究中,由于脑部荧光信号较弱,也不能排除血液对荧光信号的干扰。
因此本研究进行了离体脑组织及冠状面的成像,更为直观准确地观察各脂质体的脑部传递情况。
结果同于体外研究结果,共修饰脂质体在脑部荧光信号最强。
综上所述,本研究构建了转铁蛋白与RGD共修饰的脂质体,用于脑胶质瘤靶向性研究,考察了脂质体的性状,粒径以及电位。
通过体外细胞摄取实验、体外肿瘤球穿透实验以及脑组织离体成像证实了所构建的共修饰脂质体具有良好的脑胶质瘤靶向性,是一种潜在的脑胶质瘤靶向给药系统。
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