硝基咪唑类药物特异性抗体制备研究.docx

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硝基咪唑类药物特异性抗体制备研究

甲硝唑抗体制备研究

邱志超杨瑾

1材料与方法

1.1主要材料

1.1.1试剂

甲硝唑

琥珀酸酐

吡啶

氯仿

无水硫酸镁

N,N′-二环已基碳二亚胺（DCC）

N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）

N′N－二甲基甲酰胺（DMF）

牛血清白蛋白（BSA）

卵血清蛋白（OVA）

弗氏完全佐剂（FCA）

弗氏不完全佐剂（FIA）

酶标羊抗小鼠（二抗）

30％双氧水（H2O2）

马血清

1.1.2主要仪器

各种规格移液枪

恒温磁力搅拌器

4℃和－20℃冰箱

酶标仪

紫外分光光度计

电子天平

恒温水浴箱

冷冻离心机

洗板机

1.1.3其它材料

透析袋（新透析袋的处理：

用蒸馏水煮沸10min，冷却至室温即可使用）

96孔酶标板

一次性注射器（1mL）

离心管

剪刀、镊子

1.1.4ELISA各种试剂的配制

1.1.4.1包被液（0.1M、pH9.6碳酸盐缓冲溶液）：

将0.636gNa2CO3和1.172gNa2HCO3加到200mL蒸馏水中，装入试剂瓶中4℃保存备用。

1.1.4.2PBS贮存液（pH7.4，20倍）：

将4gKH2PO4,58gNa2HPO4•12H2O,4gKCl用蒸馏水溶解,定容至1000mL，室温贮存。

1.1.4.3PBST洗涤液（0.01M、pH7.4）：

取上述配备的PBS贮存液100mL，加入17gNaCl，再加入1900mL蒸馏水，加入1mLTween－20，混匀，室温贮存，长期贮存期间出现浑浊，不能用，另配。

1.1.4.4稀释液：

取100mLPBST洗涤液，加入0.1g明胶溶解，明胶比较难溶解，37℃水浴放置1小时，过滤即可，4℃下保存（一个星期内有效）。

1.1.4.5底物缓冲液（pH5.0）：

将0.933g柠檬酸，3.689gNa2HPO4•12H2O，加蒸馏水定容至200mL，4℃贮存（1个月内有效）。

1.1.4.6底物贮存液（发黄不可用）：

80mg邻笨二胺溶于10mL底物缓冲液中，分装贮存（0.5mL/支），怕光，操作快速，-20℃贮存。

1.1.4.7显色液：

临用前现配，取0.5mL底物贮存液避光快速解冻，加入9.5mL底物缓冲液，再加入16μl30％过氧化氢（H2O2），立即用，用后剩余的丢弃。

1.1.4.8终止液（10％硫酸）：

取10mL浓硫酸，加入到90mL蒸馏水中，室温贮存。

1.1.4.9封闭液：

2％的马血清。

1.2实验内容

1.2.1甲硝唑琥珀酸酯（MNZ－SA-COOH）的合成

取甲硝唑0.85g，琥珀酸酐1.25g，吡啶1mL，原药混合后，在磁力搅拌器上搅拌均匀，微波加热几秒。

令药品溶解完全后（不达到沸腾），在旋转蒸发仪蒸掉吡啶（70度，30分钟）。

蒸完后加约5mL冰水，将浓缩液转移至分液漏斗，用冰氯仿萃取，再用冰水洗涤氯仿液2次，在旋转蒸发仪蒸去氯仿（40度，蒸至无液体），风干得晶体。

将得到的晶体再重新溶于氯仿，加冰水洗2次，用无水硫酸镁脱水，氯仿洗吸水后的硫酸镁，合并溶液后，用旋转蒸发仪蒸发风干后得到较细的晶体。

1.2.2抗原（甲硝唑－琥珀酸－载体蛋白复合物）的合成

将0.01084g（0.04mmol）甲硝唑琥珀酸酯溶解于0.5mL二甲基甲酰胺中，加入31mg（0.15mmol）DCC，搅拌10分钟后再加入20mg（0.17mmol）NHS。

上述混合液置于室温避光搅拌反应3.5小时。

将反应液离心除去沉淀物（N,N’-二环已基脲），取上层清液加到4mL磷酸缓冲液pH8.0中，再加入30mg载体蛋白，室温避光搅拌，反应2小时后，将反应物取出，在透析袋中用0.9％的生理盐水透析3天，每天换透析液3次。

透析好的反应物分装后，保存于-20℃冰箱中。

1.2.3免疫抗原和合成抗原的合成

按照上述两种方法，分别用BSA（牛血清白蛋白）和OVA（卵血清蛋白）作为载体蛋白，合成完全抗原。

其免疫抗原分别为甲硝唑半琥珀酸酯－BSA，其包被抗原分别为甲硝唑半琥珀酸酯－OVA。

1.2.4完全抗原的鉴定

将合成的完全抗原、载体蛋白和原药按照合成的比例分别稀释到合适的浓度，然后分别对其进行紫外分光扫描，比较其图谱，分析其连接效果。

1.2.5考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度

取6支试管，按下表数据配制0～1000μg/mL牛血清白蛋白溶液各1mL

1000μg/mL牛血清白蛋白溶液（mL）

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（mL）

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

蛋白质浓度（μl/mL）

200

400

600

800

1000

准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，再加入5mL考马斯亮蓝G250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用10mm光径的比色杯在595nm下比色，作出标准曲线。

将合成的抗原稀释到一定浓度后按上法与考马斯亮蓝溶液反应，测定其OD值，并将测定的OD值代入标准曲线中以求出合成抗原中蛋白质的浓度。

1.2.5抗体的制备

1.2.5.1佐剂和免疫抗原的混合

将人工抗原慢慢解冻，根据完全抗原的实际浓度取出一定量，使其溶液中至少含有蛋白质100μg，然后加入等量的弗氏佐剂（第1次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂），混合物在旋涡混合器上充分振荡混合至W/O状态。

1.2.5.2动物实验

选择两只健康的Balb/c小白鼠，做好标记后饲养于动物房中，并按下表对小白鼠进行药物免疫。

免疫次数

免疫时间

免疫原

免疫剂量

免疫部位

——

免疫抗原和等量弗氏完全佐剂混合

100μg蛋白质

腹部、腿部肌肉

第1次免疫后两周

免疫抗原和等量弗氏不完全佐剂混合

100μg蛋白质

腹部、腿部肌肉

第2次免疫后18天

同上

100μg蛋白质

腹部

第3次免疫后三周

同上

100μg蛋白质

腹部

第4次免疫后三周

同上

100μg蛋白质

腹部

1.2.5.3血清的制备

用70％的酒精对剪刀和镊子进行消毒，同时用沾了酒精的棉花球对小白鼠的尾部末端进行消毒，用已消毒剪刀剪下小白鼠尾部的末端，然后用4mL的离心管进行采血，采血后马上进行离心处理，然后把离心后的血液放置在4℃冰箱中静置3个小时，取上层血清分装保存于－20℃冰箱中。

1.2.6ELISA法检测抗体的抑制性

抗生素间接竞争ELISA法的原理：

将抗生素分子和大分子载体蛋白质偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测抗生素和相应的抗体，固相载体上的抗生素就和待测抗生素竞争与血清中的抗体反应。

待测抗生素含量高，则被结合在固相抗原上的抗体就少，反之，结合在固相抗原上的抗体就多。

反应后加入酶标二抗，最后通过底物显色测定OD值。

当抗体的量一定时，加入的待测抗生素量越多，与固相抗原结合的抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高。

反之，发色反应增强，抑制率降低。

1.2.6.1包被抗原

分别取一定量的甲硝唑半琥珀酸酯－OVA，用包被液稀释成0.5、2.0μl/mL两个浓度。

将稀释后的抗原溶液以100μl/孔加入到酶标板上，37℃反应1小时，然后4℃冰箱中放置过夜（18～24小时）。

取出，甩干，用PBST洗涤液洗3次，拍干。

加入封闭液（马血清）200μl/孔，水浴中放置3h，甩干后用蒸馏水洗涤3次，然后放置于烘箱中2h。

1.2.6.2抗血清药效的测定

根据配制药物稀释液，将动物血清稀释800倍。

每一包被浓度的已包被酶联板（每列八孔）各取两列，左列为反应列，右列为空白对照列。

每孔先各加100μl稀释液，然后再在对每列进行由第一孔开始到第八孔的血清倍比稀释操作：

每列第一孔加100μl稀释800倍血清，混匀后将第一孔中的溶液100μl转移到第二孔，混匀，如此循环操作至第八孔，第八孔混匀后，吸出溶液100μl弃除。

倍比稀释后，在反应列各孔加50μl3μg/mL甲硝唑原药液；在空白对照列加50μl稀释液。

将上述酶联板置于振荡器中振匀20min。

把空板中的液体转移到包被板上，37℃温箱中孵育1h。

PBS洗涤液洗涤3次，甩干，加入100μl酶标二抗（1：

8000），37℃温箱中孵育1h。

PBS洗涤液洗涤3次，甩干，加显色液，避光反应15min，加入终止液。

酶标仪测定OD值。

2实验结果与分析

2.1目标产物的1H-NMR

图1目标产物结构

图2目标产物的1H-NMR

1H-NMR（400MHz，CDCl3）：

δ7.96（s，1H，-CH），4.59~4.61（t，J=5.1Hz，2H，-CH2-O-），4.47~4.49（t，J=5.0Hz，2H，-N-CH2-），2.61~2.64（m，2H，-CH2-COOH），2.55~2.59（m，2H，-CH2-COO-），2.53（s，1H，-CH3）。

2.55~2.64处的多重峰可能是因为甲硝唑半琥珀酸酯的羟基上的H和脂基上的羰基的O形成氢键成环，造成二级结构，形成2个AB结构，致使两个亚甲基上的H化学位移值不同。

2.2目标化合物物的+ESI-MS

图3目标化合物物的+ESI-MS

图4目标化合物的可能裂解机理

对产物进行了+ESI-MS鉴定，出现分子离子峰（M+H=272），对分子离子峰进行+ESI-MS2鉴定，出现碎片离子峰m/z=155（144+H），进一步对144碎片离子峰进行+ESI-MS3鉴定，出现碎片离子峰m/z=99（98+H），各种碎片都能归属，目标化合物的质谱裂解机理可能如图所示。

2.3目标化合物的IR谱

图5目标化合物的IR谱

IR：

3127cm-1为υ=C-H，1747cm-1为羧酸υC=O，1722cm-1为酯υC=O，1537cm-1为咪唑环上υasNO2，1477cm-1为酯和咪唑环间的υCH2，1458cm-1为咪唑环上的υCH3，1367cm-1为υsNO2，1265cm-1为酸υC-O，1163cm-1为咪唑环与硝基间的υC-N，1199cm-1为咪唑环上两个双键间的υC-N，，1207cm-1为咪唑环与酯间的υC-N，表明与目标结构吻合。

2.4免疫抗原紫外分光扫描

图6青霉素、青霉素－BSA、BSA的紫外图谱

绿线：

甲硝唑琥珀酸酯—BSA

蓝线：

BSA

黑线：

甲硝唑琥珀酸酯

2.5考马斯亮蓝法测定合成抗原蛋白质的浓度

图7考马斯亮蓝蛋白质标准曲线

由上图可得回归方程：

y=0.009x,x为蛋白质浓度，y为吸光值。

则有：

甲硝唑琥珀酸酯－BSA的OD值为0.219，则其蛋白质浓度为243.333μg/mL

甲硝唑琥珀酸酯－OVA的OD值为0.241，则其蛋白质浓度为267.778μg/mL

2.5ELISA法检测原药对血清抗体的抑制性

2.5.1不同的封闭液和包被抗原浓度下原药（原药浓度3μg/mL）对血清抗体的抑制性的影响

2.5.1.1用脱脂奶粉封闭酶联板包被抗原浓度为0.5μg/mL

表1血清检测结果（原药浓度3μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

0.804

0.472

0.278

0.285

0.173

0.123

0.097

0.069

空白对照

0.827

0.441

0.331

0.229

0.172

0.140

0.105

0.086

图8脱脂奶粉封闭包被抗原浓度为0.5μg/mL的血清抗体抑制性检测

2.5.1.2脱脂奶粉封闭酶联板包被抗原浓度为2μg/mL

用脱脂奶粉封闭，稀释液不加甲醇或DMF，原药不含甲醇或DMF。

鼠2的原药2μg/mL有抑制，但同列数据梯度有波动。

表2血清检测结果（原药浓度3μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

1.149

0.302

0.409

0.366

0.228

0.158

0.116

0.087

空白对照

1.356

0.731

0.61

0.436

0.237

0.167

0.115

0.113

图9脱脂奶粉封闭包被抗原浓度为2μg/mL血清抗体的抑制性检测

2.5.1.3用马血清封闭酶联板包被抗原浓度为0.5μg/mL

表3马血清封闭包被浓度为0.5μg/mL的血清抗体抑制性检测结果

（原药浓度3μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

1.29

0.865

0.552

0.446

0.321

0.269

0.23

0.16

空白对照

1.193

0.831

0.546

0.472

0.365

0.271

0.24

0.172

图10马血清封闭包被抗原浓度为0.5μg/mL的血清抗体抑制性检测

2.5.1.4马血清封闭包被抗原浓度为2μg/mL的血清抗体抑制性

表4马血清封闭包被浓度为2μg/mL的血清抗体抑制性检测结果

（原药浓度3μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

0.818

0.565

0.3

0.258

0.187

0.114

0.086

0.045

空白对照

1.066

0.615

0.393

0.292

0.174

0.105

0.089

0.043

纯OVA包被

0.470

0.305

0.154

0.103

0.082

0.062

0.057

0.050

阴性血清

0.071

0.062

0.053

0.05

0.061

0.051

0.048

0.042

图11马血清封闭包被抗原浓度为2μg/mL的血清抗体抑制性检测

由2.5.1可知，当固定原药浓度为3μg/mL时，无论是用马血清还是用脱脂奶粉封闭，包被抗原浓度为2μg/mL时，显示出原药对血清抗体的抑制性；包被抗原浓度为0.5μg/mL时，原药对血清抗体的抑制性不明显。

另一方面，用马血清封闭组显色梯度比较稳定，血清稀释倍数和OD值有较好的反向变化关系，但用脱脂奶粉封闭则会出现OD值波动。

因此，用马血清封闭的效果比用脱脂奶粉封闭的好，

2.5.2不同的溶剂介质和包被抗原浓度下原药（原药浓度3μg/mL）对血清抗体的抑制性的影响

2.5.2.1包被抗原浓度为0.5μg/mL下含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性的影响

表5以含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

（包被抗原浓度0.5μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

0.054

0.044

0.031

0.032

0.033

0.031

0.030

空白对照

0.055

0.047

0.045

0.041

0.039

0.034

0.036

0.034

纯OVA包被

0.135

0.099

0.060

0.055

0.054

0.046

0.048

0.035

阴性血清

0.047

0.051

0.045

0.043

0.042

0.050

0.048

图12包被抗原浓度0.5μg/mL下含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

2.5.2.2在包被抗原浓度为2μg/mL下以含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性的影响

表6以含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

（包被抗原浓度2μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

0.110

0.098

0.090

0.060

0.040

0.047

0.037

0.033

空白对照

0.340

0.407

0.202

0.169

0.105

0.074

0.048

0.038

纯OVA包被

0.135

0.099

0.060

0.055

0.054

0.046

0.048

0.035

阴性血清

0.097

0.06

0.053

0.052

0.053

0.054

0.061

0.056

图13包被抗原浓度2μg/mL下含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

2.5.2.3在包被抗原浓度为0.5μg/mL下以含5%乙醇稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性的影响

表7以含5%乙醇稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

（包被抗原浓度0.5μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

0.239

0.148

0.121

0.094

0.080

0.050

0.060

0.053

空白对照

0.107

0.077

0.059

0.139

0.048

0.044

0.049

0.057

纯OVA包被

0.135

0.099

0.060

0.055

0.054

0.046

0.048

0.035

阴性血清

0.047

0.051

0.045

0.043

0.042

0.050

0.048

图14包被抗原浓度0.5μg/mL下含5%乙醇稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

2.5.2.4在包被抗原浓度为2μg/mL下以含5%乙醇的稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性的影响

表8以含5%乙醇稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

（包被抗原浓度2μg/mL）

血清稀释倍数

800

1600×

3200×

6400×

12800×

256000×

512000×

204800×

加原药

（3μg/mL）

0.230

0.183

0.124

0.279

0.077

0.049

0.053

0.048

空白对照

0.222

0.221

0.153

0.131

0.084

0.064

0.050

0.037

纯OVA包被

0.135

0.099

0.06

0.055

0.054

0.046

0.048

0.035

阴性血清

0.097

0.06

0.053

0.052

0.053

0.054

0.061

0.056

图15包被抗原浓度2μg/mL下含5%乙醇稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性检测结果

由2.5.2可知，当固定原药浓度为3μg/mL，包被抗原浓度为2μg/mL时，在不同的溶剂介质中原药对血清抗体的抑制性有很大差别。

以含1%DMF稀释液配制的原药对血清抗体的抑制性较明显增加，而以含5%乙醇稀释液配制的原药则对血清抗体的抑制性产生不稳定的波动。

其原因有待进一步的研究。

3总结

3.1硝基咪唑类药物是一类具有杀菌或抑菌活性的药物，但应用量过大或使用不当，都可残留于肉、蛋、奶、水产品等动物性食品，威胁人们身体健康，损害我国国际贸易利益，但国内尚未见其现场快速检测方法研究报道。

本课题以甲硝唑为对象，研究合成其人工抗原，进一步研制其单克隆抗体和多克隆抗体，为后期建立硝基咪唑类残留药物快速检测方法奠定基础。

3.2甲硝唑琥珀酸酯的合成是重点，也是本实验的特色和创新之处。

在合成时，应注意以下几点问题：

混合后的原药在微波炉内加热时一定要留意，不能使之沸腾，可以分段加热；萃取操作时所用的氯仿一定要冰的。

3.3ELISA法检测原药对血清抗体的抑制性的实验过程中，吸光值随稀释倍数的梯度变化有时不够稳定，这可能是由于酶联板包被质量不高造成的，实验得出的数据表明，用马血清包被比用脱脂奶粉包被效果要好，但用马血清包被也有出现梯度变化不稳定的情况。

另外，原药在介质中的溶解性也影响对血清抗体的抑制性，这在实验中得到了证实。

原药溶解较好，则能使其在溶液中分散均匀，有利于准确稀释和与抗体进行免疫反应。

如何提高原药在溶剂介质中的溶解性有待进一步的研究。

3.4实验研究是一个漫长而又艰辛的过程。

实验本身就是在不断的失败中探索前行，特别是在合成单酯的部分，摸索出整个实验方法经历了较长的时间，我们遇到了不少挫折，也曾动摇过信心，但在老师的悉心指导和鼓励下，最终合成成功。

整个实验过程中，感谢老师一直在旁提供支持和帮助，既引导我们多方位地思考问题，同时又给我们自己发挥的空间。

在实验中学到的是知识和技能，在老师身上学到的是责任和态度。

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