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佛山科学技术学院
佛山科学技术学院
《动物繁殖学》
实验指导书
主编：
田允波何兰花曾书琴
动物科学系
2001年1月3日
目录
实验一人工授精器材的配置认识及假阴道的安装调试………………….4
实验二家畜人工授精录像………………………………………………….8
实验三精液品质的常规检查及理化因素对精子的影响…………………10
实验四常用精液稀释液的配制……………………………………………14
实验五精子数量计算和畸形率的测定……………………………………17
实验六精子顶体观察………………………………………………………23
实验七精液冷冻……………………………………………………………27
实验八母畜妊娠诊断………………………………………………………30
附家畜人工授精技术操作规程
一、牛冷冻精液人工授精技术操作规程………………………………..34
二、猪人工授精技术操作规程…………………………………………..37
三、羊人工授精技术操作规程…………………………………………..40
四、犬人工授精技术操作规程…………………………………………..43
五、兔人工授精技术操作规程…………………………………………..45
主要参考文献：
[1]张嘉保，周虚主编.动物繁殖学.吉林科学技术出版社.1999.
[2]北京农业大学主编.家畜繁殖学（第二版）.农业出版社.1992.
[3]张一铃主编.家畜繁殖学实验实习指导.农业出版社.1995.
简要说明
本实验指导书是根据我国高等农林本科动物科学专业教学计划《动物繁殖学》教学基本要求编写的。
包括课堂教学实验和动物人工授精技术操作规程两部分。
使学生在学习动物繁殖生理基础理论的过程中，重点学习动物繁殖技术的操作方法。
课堂教学实验是为了加深、验证动物繁殖理论和各种繁殖技术的操作要领，进一步系统地掌握动物人工授精技术和妊娠诊断技术，以培养学生独立操作的技能。
本实验指导书适用于动物科学和动物医学专业（包括全日制本科、专科和成人教育）。
动物科学专业至少应开实验5个。
本实验指导书系初次编写，在使用过程中如有不妥之处，敬请教师和同学们提出意见，以便加以修正。
编者
2001年1月
实验一人工授精器材的配置、认识及假阴道的安装调试
一、实验目的
1．熟悉家畜人工授精所使用的各种器械，了解其用途、构造和使用方法。
2．掌握假阴道的安装方法。
二、实验内容
介绍家畜人工授精的主要器材以及假阴道的安装方法。
三、实验仪器、设备及材料
1．消毒用具手提式高压蒸汽灭菌器、煮沸消毒器、酒精灯、紫外线灯。
2．采精用具各种家畜假阴道、温度计、玻璃棒、润滑剂、长柄钳等。
3．精液品质检查用具量精杯、显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温盘）、血球计算盘、酸度计、烧杯、盖、载玻片、玻棒等。
4．配制稀释液用具及运输、保存精液容器量筒、天平、药匙、漏斗架、滤纸、冰箱、
广口保温瓶、贮精瓶。
5．输精用具各种家畜用的开膣器及各式输精器械、头灯或手电筒、注射器等。
6．精液冷冻设备液氮罐、精液冷冻器械、各种类型冷冻精液、细管精液输精器等。
7．一般用品玻璃棒、脱脂棉、纱布、大玻璃瓶、小玻璃瓶、标签、大搪瓷盘、小槽
瓷盘、水桶、热水瓶、面盆、毛巾、肥皂、工作服等。
8．常用药品酒精、新洁尔灭、稀释液用药品、白凡士林，染色剂、蒸馏水等。
四、实验步骤
（一）了解人工授精所需用的器械、用具，特别是采精和输精器械以及冷冻精液器械的名称、构造、用途和使用方法。
1．假阴道
（1）牛、羊用假阴道
牛、羊假阴道的构造基本相同，唯羊用假阴道较小。
牛、羊假阴道的外壳系用硬橡胶或硬质塑料制成。
内胎是由软橡胶或乳胶制成，装入外壳中并翻卷于外壳两端，加固定圈固定之，在假阴道的一端安装上集精杯。
集精杯有两种，一种是夹层棕色玻璃集精杯，外面用专用的集精杯固定套固定之。
另一种是在橡胶漏斗上套上一个玻璃管，连同假阴道－并装入人造革保温套内。
假阴道的外壳中部有一注水孔，可插入带有气门活塞的橡皮塞。
在外界气温低时采精，应在集精杯夹层内灌入热水，以免精液遭受低温打击。
（2）猪用假阴道
猪假阴道的外形和构造基本上与牛、羊假阴道相同。
不同的是较牛假阴道短些，使用双联气球维持并控制内胎的压力变化。
集精瓶容量较大，用乳胶漏斗固定在假阴道外口上。
目前多改用徒手采精，不再使用假阴道。
2．输精器械
（1）牛用输精器械
目前牛输精器多系金属制成，为长约38-40cm的细管，下端可插入一注射器或橡胶滴头。
图1各种家畜的假阴道
A.欧美式牛用加阴道B.苏联式牛用假阴道C.西川式牛用假阴道D.羊用假阴道E.猪用假阴道
1.外壳2.内胎3.橡胶漏斗4.集精管（或集精杯）5.气嘴6.水孔7.温水8.固定胶圈9.集精杯固定套10.瓶口小官11.假阴道入口泡沫垫12.双链球
细管输精器是专为细管冷冻精液配套使用的。
一般是由－金属制的外套和里面的推杆组成，使用时将精液细管的一端剪去，将另一端装置于输精器的推杆上，推动椎杆，借助细管中的封闭塞即可将溶解后的精液排出。
（2）羊用输精器械
是一种玻璃管注射器型输精器，也有采用金属管型输精器的。
羊用输精器的形状和牛用输精器一样，唯在长度和细度上小一些。
（3）猪用输精器械
是一种长40-45cm、直径1.2cm粗的硬橡胶管，前端钝圆（或可制成螺旋形），后端可插入注射器或连接在精液瓶上。
3．冷冻精液设备
（1）冷源
液态氮是利用空气分离设备-液氮机，将空气重复压缩、膨胀、冷却、液化后呈透明状的液化空气。
再将液化空气进一步冷却，即可分离成为液化氮、液化氧和液化氩。
液氮的温度为-196℃。
（2）冷冻精液保存容器
保存冷冻精液的专用容器为液氮容器。
液氮是超低温的液化气体，吸热后易气化，所以液氮必须保存在专用的液氮容器内，贮氮容器有：
杜瓦瓶、贮氮罐、贮氮槽、贮氮车和贮精罐等。
大型容器可贮数千升液氮，小的可容数十升，最小的不到1L。
保存冷冻精液常用的是中、小型贮精罐。
一般是用铝合金制成的。
图2各种家畜的输精器
B.牛用胶球输精器C.牛用注射输精器D.牛用细管输精器E.羊用注射输精器F.猪用注射输精器
1.注射器活塞夹2.刻度板3.注射器圆筒夹4.螺旋转轮5.容量2ml羊用导管注射器6.容量4ml牛用导管注射器7.胶球8.玻璃管9.推杆10.推杆调节处12.嘴管（装精液细管）15.容量30ml羊猪导管注射器16.各种猪用输精管
（3）冷冻精液类型
颗粒型：
将精液在液氮降温的冷冻板上滴冻成0.1ml左右的丸剂，待用解冻液溶解后，用一般人工授精输精器输精。
安瓿型：
将精液分装于安瓿中，在液氮蒸气中冻结。
加热溶解后用一般人工授精器输精。
细管型：
将精液分装于0.5ml或0.25ml的细塑料管内，经液氮蒸气冻结，加热溶解后，用专用的细管精液输精器输精。
4．手提式高压灭菌器消毒
消毒器械和稀释液时，要求灭菌器压力维持在0.7kg／cm2（器内温度为115℃）经30min消毒。
若只消毒器械，可维持1.0kg／cm2（温度120℃）经20min即可。
（二）假阴道的安装
1．安装前的检查工作
（1）假阴道外壳是否有裂缝或小孔。
（2）假阴道内胎是否漏气、内胎的光滑面应为内壁，边缘是否有裂损。
（3）气门活塞是否完好或漏气、扭动是否灵活。
2．安装方法
（1）将假阴道内胎装入外壳中，光滑面应朝向内腔。
（2）将假阴道外壳夹在安装者的大腿之间，使内胎的两端翻卷于外壳两端上，注意使内胎不得扭曲，内胎的中轴应与外壳中轴重合，即内胎的两端和外壳的两端应成为同心圆位置。
（3）用橡皮圈将两端扎紧。
（4）用75％酒精棉球擦拭消毒内胎壁。
（5）在假阴道夹层内注热水，使其温度达38-40℃。
（6）在假阴道内胎腔的前1／2段涂以经消毒的润滑剂。
（7）安装上气门活塞，吹入适量空气，使内胎一端的中央形成“Y”形。
（8）装上集精杯，加集精杯保护套。
（9）用消毒毛巾盖住假阴道的开口端，以备采精。
五、实验报告要求
1．实验名称、学生姓名、班号和实验日期；
2．实验目的和要求；
3．实验仪器、设备与材料；
4．实验步骤；
5．讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
六、实验注意事项
1．安装者的指甲须剪短，以免将内胎掐破。
2．安装好的假阴道须稳妥平置，勿碰及其他硬物，以免损伤内胎。
七、思考题
试述牛假阴道的组成和安装时要求；进行采精时应具备哪些条件？
实验二家畜人工授精录像
一、实验目的
1．了解猪、牛等家畜的人工授精操作的全过程。
2．掌握冷冻精液的制作程序及操作要领。
二、实验内容
观看猪、牛的人工授精操作的全过程的录像片。
三、实验仪器、设备及材料
录像机，各种家畜人工授精的录像带；
四、实验步骤
（一）观看对牛的人工授精全过程。
1．采精前准备采精场准备工作，采精架、台畜的清洁。
2．假阴道的结构和安装。
3．采精时采精员如何操作、重点领会当公牛开始爬跨时采精员站的位置。
如何将公牛阴茎套进假阴道中，公牛射精后如何使精液流入集精杯中。
4．对母牛输精方法、输精时的操作要领。
5．了解冷冻精液的制作方法及操作程序，包括：
稀释液配置、稀释、平衡、滴冻、保存、解冻等步骤。
（二）观看猪的人工授精工作的全过程。
1．采精台的式样、构造。
2．用手握法对公猪采精的方法。
3．公猪射精的特点，采精员在采精时应注意的事项。
4．对母猪的输精方法。
五、实验报告要求
1．实验名称、学生姓名、班号和实验日期；
2．实验目的和要求；
3．实验仪器、设备与材料；
4．实验步骤；
5．讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
六、实验注意事项
注意观察牛、猪人工授精的程序的差异。
七、思考题
叙述牛、猪人工采精和输精的操作步骤。
实验三精液品质的感观检查及精子活率、
密度检查，理化因素对精子的影响
一、实验目的
1．掌握精液常规检查的方法，锻炼评定精液品质的能力。
2．验证理化因素对精子运动及生存性能的影响。
二、实验内容
1．猪精液品质感官检查、精子密度和活率检查。
2．温度、渗透压、化学药物、pH值等理化因素对精子的影响。
三、实验仪器、设备及材料
1．精液选用牛、羊、猪、犬、兔任意一种动物的新鲜精液。
2．器械、药品显微镜、显微镜保温箱（或显微镜恒温台）、载玻片、盖玻片、搪瓷盘、
温度计、滴管、擦镜纸、pH试纸、红外线灯、冰块、纱布、蒸馏水、3％和0.9％氯化钠溶液、0.2％煤酚皂溶液、1/1000新洁尔灭溶液、75％酒精、pH4、pH7、pH10的0.9%氯化钠溶液。
3．其他精子密度挂图及有关图表。
三、实验步骤
（一）精液的感观检查
观察测定下列各项结果并记入登记表内。
1．测定射精量
将采得的精液倒入有到度的试管或集精杯中，测量其容量。
也可以取一只大小相同的空瓶量入清水，放在桌面同一水平上间接测得精液量，这样可以减少污染机会。
各种家畜的平均射精量为：
牛4（2-10）m1，羊1.0（0.7-2.0）m1，猪250（150-500）m1。
2．色泽、气味观察
观察精液的色泽，并嗅闻气味。
3．云雾状的观察
观察牛、羊精液翻腾滚动的云雾状态，并按以下符号记入表内，云雾状显著者以“+++”表示，有云雾状者以“++”表示，云雾状不明显者以“+”表示。
4．pH值的检测
用玻璃棒取一滴原精液滴于pH试纸上，立即在标准比色板上比色，然后读出相应的数据。
（二）精子密度检查及活率评分
1．检查精子的密度
图3牛精子浓度示意图
取1小滴精液滴在清洁的载玻片上，加上盖玻片，使精液分散成均匀一薄层，不得存留气泡，也不能使精液外流或溢于盖玻片上，置于显微镜下放大400-600倍观察，按下列等级评定其密度。
密——在整个视野中精子密度很大，彼此之间空隙很小，看不清楚各个精子运动的活动情况，这一级属于“密”，每毫升精液含精子数约在10亿个以上，登记时记以“密”字。
中——精子之间的空隙明显，精子彼此之间的距离约有一个精子的长度、有些精子的活动情况可以清楚地看到。
这种精液的密度评为“中”，每毫升所含精子数约在2-10亿个之间；登记时记以“中”字。
稀——精子分散于视野内，精子之间的空隙超过一个精子的长度，这种精液每毫升所含精子是在2亿以下。
登记时记以“稀”字。
2．评定精子的活率
必须于采精后立刻在22-26℃的实验室内进行，最好是在37℃保
温箱内进行，在评定精子活率的同时也可以测定精子的密度。
0.8级0.6级0.3级
图4精子活动评分标准图
（白色精子为前进运动，黑色精子为非前进运动）
用玻璃棒蘸取1滴原精液或经稀释的精液（马、猪精液的精子密度低，可不须稀释，而牛、羊精液的精子密度大，须用0.9％氯化钠溶液稀释，其温度须与精液温度相近），滴在载玻片上，加上盖玻片，其间应充满精液，不使气泡存在，也可滴在盖玻片上翻放于凹玻片的凹窝上，置于显微镜下放大250-400倍检查。
注意显微镜的载物台须放平，最好是在暗视野中进行观察。
精子的活动有3种类型，即直线前进运动、旋转运动和振摆运动。
评价精子的活率是根据直线前进运动精子数的多少而定的。
精子活率=呈直线前进运动精子数/总精子数×100%
目前评定精子活率等级的方法有两种：
十级制——在显微镜视野中估测直线前进运动精子所占全部精子的百分数。
直线前进运动的精子为100％者评为1.0级；90％者评定为0.9级；如此类推。
牛及羊的精液中由于副性腺分泌物少，精子密度大，因此要求精液达到“0.6”级（即密度为“密”，活率为“0.6”级）及“中0.8”级以上才能作为合格的精液。
而马、猪的精液中副性腺分泌物多，精子密度小，因此正常的精液定为“中0.6”、“稀0.8”以上的等级。
（三）理化因素对精子的影响
1．温度的影响
（1）将采得的新鲜原精液1滴滴在载玻片上，置于显微镜下观察其精子活率，再放在45-50℃温度下2min，观察精子活率有何变化。
（2）将采得的新鲜精液立即作精子活率评定后，随后即移入0-5℃温度下经2-3min，再将精液温度回升到35-37℃下进行精子活率评定，注意观察降温前后精子活率的变化。
2．渗透压的影响
将新鲜原精液作出精子活率评级后，分别在3滴原精液内各加入1％氯化钠溶液、3％氯化钠溶液和蒸馏水1滴，混合均匀后观察精子活率及精子形态有何变化。
3．化学消毒药物的影响
取1滴精液于载玻片上，覆以盖玻片立即评定精子活率，再用滴管分别在盖玻片边缘滴入以下药物，使之进入精液层内：
（1）2％煤酚皂溶液；
（2）1/3000新洁而灭溶液；（3）75％酒精。
分别观察精子活率及形态有何变化。
4．pH值的影响
将新鲜原精液作出精子活率评级后，分别在3滴原精液内各加入pH为4、7、10的0.9%氯化钠溶液一滴，静置片刻后，再观察精子的活率及形态的变化。
五、实验报告要求
1．实验名称、学生姓名、班号和实验日期；
2．实验目的和要求；
3．实验仪器、设备与材料；
4．实验步骤；
5．实验原始记录；
6．实验结果分析，讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
六、实验注意事项
1．取样要准确。
2．使用药品时滴管要专用。
七、思考题
将本次实验所观测结果填入下列表内。
种公畜精液品质检查登记表
畜别
畜号
采精时间（年月日）
射精量（ml）
色泽
气味
云雾状
密度
活率
理化因素对精子活率影响记载表
处理前
活率评分
处理后
活率评分
35-37℃
40-45℃
降温处理前
降温处理后
加入不同浓度溶液前
加入1%氯化钠溶液
加入3%氯化钠溶液
加入蒸馏水
加入药液前
加入2%煤酚皂溶液
加入1/3000新洁尔灭溶液
加入75%酒精
加入不同pH值溶液前
加入pH4的0.9%氯化钠溶液
加入pH7的0.9%氯化钠溶液
加入pH10的0.9%氯化钠溶液
实验四常用精液稀释液的配制
一、实验目的
通过实验，掌握精液稀释液的配制与应用。
二、实验内容
牛、猪低温和常温保存的稀释液的配制。
三、实验仪器、设备及材料
1．新鲜牛或猪精液。
2．柠檬酸钠、新鲜牛奶、氨基乙酸、葡萄糖、鲜鸡蛋、氨苯磺胺、氯化钠、蒸馏水、青霉素、链霉素、75%酒精。
3．量筒、漏斗、玻棒、载玻片、盖玻片、三角烧瓶（100一200m1）、温度计、天平、烧杯、注射器（1、10、20ml）、三角架、药勺、酒精灯、显微镜、水浴锅、大方盘、纱布、药棉、肥皂、滤纸、平皿、铝盒、面盆。
四、实验步骤
（一）各种家畜精液常用稀释液及配方
1．猪精液常用稀释液配方及配制方法
①葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液（低温保存）
基础液：
柠檬酸钠0.5g葡萄糖6g蒸馏水100ml
稀释液：
基础液97ml卵黄3ml
青霉素1000IU／ml链霉素1000微克／ml。
配制方法：
先将基础液中的药品称量并溶解于蒸馏水中，过滤后，煮沸消毒，待冷却后加入卵黄及抗生素即可。
②葡萄糖-柠檬酸钠液（常温保存）
基础液：
柠檬酸钠0.5g葡萄糖5g蒸馏水100ml
稀释液：
基础液100ml
青霉素1000IU／ml链霉素1000微克／ml。
配制方法：
先将基础液中的药品称量并溶解于蒸馏水中，过滤后，煮沸消毒，待冷却后加入抗生素即可。
③牛奶液（低温保存）
牛奶100ml青霉素1000IU／ml链霉素1000微克／ml。
配制方法：
牛奶最好用新鲜脱脂奶。
也可将新鲜奶静置于5℃的冰箱中，乳脂上浮后吸取下层脂肪少的使用。
牛奶灭菌待冷却后才加上抗生素。
2．牛精液常用稀释液配方及配制方法
①柠檬酸钠-卵黄液（低温保存）
基础液：
柠檬酸钠2.9蒸馏水100ml
稀释液：
基础液75ml卵黄25ml
青霉素1000IU／ml链霉素1000微克／ml。
配制方法：
先将基础液中的药品称量并溶解于蒸馏水中，过滤后，煮沸消毒，待冷却后加入卵黄及抗生素即可。
②葡萄糖-柠檬酸钠-卵黄液（低温保存）
基础液：
柠檬酸钠1.4g葡萄糖3g蒸馏水100ml
稀释液：
基础液80ml卵黄20ml
青霉素1000IU／ml链霉素1000微克／ml。
配制方法：
先将基础液中的药品称量并溶解于蒸馏水中，过滤后，煮沸消毒，待冷却后加入卵黄及抗生素即可。
（二）精液稀释方法
1．精液的准备
猪精液用4-6层消毒纱布过滤，以除去精液中的胶质（牛、羊的不需要过滤），镜检精子的活率。
2．稀释液的准备
根据稀释倍数（猪精液一般稀释2-4倍），准确量取精液稀释液。
3．等温
将精液与稀释液置于30℃下等温（用30℃水浴锅或盛装30℃温水的面盆均可）。
4．稀释
将同温度的精液稀释液沿精液瓶壁缓慢地加入到精液中，轻轻摇匀即可。
五、实验报告要求
1．实验名称、学生姓名、班号和实验日期；
2．实验目的和要求；
3．实验仪器、设备与材料；
4．实验步骤；
5．实验原始记录；
7．实验结果分析，讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
六、注意事项
1．操作室的温度应保持在18℃-25℃，并避免阳光、药水、烟气等对精子产生不良影响。
2．抽取卵黄时，蛋壳破开处应先消毒、擦干；破开位置应偏向大头，蛋黄留在小头一端，并除去蛋清。
也可将蛋黄倒在消毒的平皿中。
抽取时用注射器（或牙签）刺破卵黄膜并伸入卵黄中抽取所需的卵黄。
3．药品应为化学纯剂制，并经过滤后方可使用。
使用的蒸馏水应新鲜，配制的稀释液必须对精子无害，液量超过500ml时应分瓶消毒，消毒后用棉花纱布塞好，防止杂物污染。
4．稀释液的酸碱度（pH）必须适宜，稀释精液时动作要轻，不能骤然倒入，以免稀释打击。
5．稀释液和用具必须消毒（卵黄和抗生素可不消毒），稀释液经煮沸减少的水分，应用无菌蒸馏水补充，以保持原来的浓度。
6．精液稀释前需进行活率和密度的测定，品质良好的方可进行稀释；稀释后的精液，经检查如品质不好的则不宜作输精用。
稀释后精液的活力不得低于原精液，否则，应检查操作过程是否恰当。
附：
精液稀释倍数参照表（具体按精子密度而定）
家畜种类
稀释倍数
输精剂量ml）
活精子数
牛
10—40
1
2000-5000万
猪
2—4
30—40
20亿
七、思考题
精液稀释液应如何配制？
配制精液稀释液时应注意哪些问题？
实验五精子数量计算和畸形率的测定
一、实验目的
1．掌握测定每毫升精液中所含精子数的方法，以及测定精子畸形率的操作要点。
2．测定每一头份冷冻精液内有效精子数，以确定是否符合输精标准要求。
二、实验内容
1．精子数量测定。
2．每头份冷冻精液中有效精子数的测定。
3．测定精子畸形率。
三、实验仪器、设备及材料
1．材料
任选一种公畜或雄性实验动物的新鲜精液及冷冻精液。
2．器械
显微镜、载玻片、盖玻片、红细胞及白细胞稀释管、血（色素）吸管、血细胞计算盘、光电比色计、5ml试管、1m1及2ml吸管、玻棒、染色缸、染色架，玻片镊、纱布。
3．几种染色液配方
（1）0.5％龙胆紫0.5g96％酒精100ml
（2）酒精固定液
40％甲醛（福尔马林）12.5m196％酒精87.5ml
（3）凡那他氏镀银染色液
①胡氏固定液
福尔马林2rnl醋酸1m1蒸馏水100m1
②染色液
单宁酸5g石炭酸1g蒸馏水100m1
③硝酸银溶液
硝酸银0.25g蒸馏水100m1
（4）威廉斯染色液
①品红原液
品红10g96％酒精100ml
②伊红原液将伊红溶于酒精中制成饱和溶液。
③染色液
品红原液10m15%石炭酸100ml
取混合液50ml伊红原液25ml
注：
充分混合，至少放置14天后，经过滤可用于精子染色。
④美蓝原液
美蓝10g酒精（96％）100ml
4．畸形精子形态图、血细胞计算盘构造图
四、实验步骤
（一）精子数量测定
1．血细胞计算盘测定法
（1）清洗器械先将血细胞计算盘及盖玻片用蒸溜水冲洗，使真自然干燥。
血吸管或红细胞和白细胞稀释管先用蒸馏水冲洗，再用95％酒精清洗，最后用乙醚清洗。
试管及吸管洗净后须经烘干。
（2）精液的稀释
①用lml吸管准确吸取3％NaCl0.2ml或2ml，注入小试管中。
根据稀释倍数的要求，再用血吸管吸出10或20μlNaCl溶液弃去。
②用血吸管或红、白细胞稀释管吸取精液至10μl刻度或20μl处。
③用纱布擦去吸管尖端附着的精液。
将精液注入到小试管中。
图5经稀释后的精液
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