培养基验收作业指导书删减版.docx

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培养基验收作业指导书删减版

培养基质量控制作业指导书

1、目的：

为加强我微生物实验室的工作管理，保证实验室的检测质量，特制定此作业指导书；

2、范围：

本规范适用于实验室微生物检测中所使用培养基的质量控制。

3、职责：

3.1检验人员：

按照本规程规对培养基使用前及使用过程中进行质量控制，确保培养基符合相关标准的要求。

3.2科室负责人：

负责指导、监督检验人员对培养基进行质量控制。

4、控制措施：

4．1培养基的购置和验收

4.1.1培养基的购置

试剂管理员在接到批准的采购信息后，从合格供应商中选择厂商采购，同时要求厂商提供每批培养基的批号、使用前的pH值、储藏信息、有效期、性能评价记录（包括测试菌株、技术数据清单、质控证书及必要的安全危害数据）。

4.1.2培养基的验收

购买培养基到货后，由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求。

同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后，交由检测人员接受保管，填写培养基入库记录和建立试剂台帐。

4．2培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在有效期或6个月内用完。

应每月对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

开封的脱水培养基，每次使用前应对其质量进行检查，通过粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断培养基的质量变化。

若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。

即用性培养基按照产品标识要求进行储存。

4．3培养基的使用

4.3.1配制培养基用水和玻璃器皿

　　培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水，每周检测电阻率，每三个月检测一次重金属离子含量。

制备培养基所用的玻璃器皿（如吸管、试管、烧杯等）新的玻璃器皿（首次使用）和再次使用的玻璃器皿按规定方法洗涤、干燥

4.3.2称量

　　称量时要用专用的角匙，避免交叉污染而影响检验结果；干粉培养基易吸潮，如房间环境湿度较大时，应提高称量速度，完毕后及时盖紧瓶盖。

4.3.3复水

　　复水时应注意以下事项：

a）不得用铜锅或铁锅，以防有离子混入培养基中，影响微生物的生长；

b）容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上，避免在加热溶解过程中，培养基溢出；

c）加热培养基时一定要进行搅拌，特别是琼脂类培养基；

d）为避免烧焦和沸腾溢出，对于少量的培养基最好使用沸水浴进行加热；

e）含有琼脂粉的培养基，在加热溶解之前可以浸泡数分钟；

f）对于琼脂类培养基进行再融化时应使用沸水浴或流动蒸汽进行加热，最多只能加热两次，第二次再融化后仍未用完的培养基应弃去；

g）烧糊的培养基营养物质被破坏，并可产生有毒物质，如发现焦化，或未溶解均匀前培养基有溢出，该培养基即不能使用，应重新制备。

4.3.4灭菌

　　培养基采用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌），通常是121℃15min，含糖或特殊培养基，按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。

已配制好的培养基必须在15分钟内灭菌，避免微生物生长繁殖而消耗养分，改变培养基的酸碱度。

为避免高温破坏培养基的营养成分，降低琼脂的凝胶强度，必须严格控制灭菌温度和时间，不可重复灭菌。

4.3.5pH测定

　　在初次使用每批培养基时，均需随同检测配制一个测试培养基，在灭菌或消毒后应在25℃温度下采用精密PH试纸测试PH值，并判断是否符合要求；使用过程中，如果需要调整培养基的pH，应用1mol/LNaOH或lmol/LHCL调整，注意不可反复调pH，否则会影响培养基的渗透压。

4.3.6配制好的培养基标识和保存

灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度，避免长时间保存在灭菌锅内，造成过度灭菌，影响培养基的营养成分或选择性效果。

同时填写配制记录。

内容：

名称、配制量、配方（比）、操作中的重要参数（时间、压力、温度）、配制日期、配制者、截止使用日期。

在每个已灭菌的培养基容器外做好标记，注明名称、配制日期、使用期限和配制人。

培养基保存注意事项：

1）环境条件：

各种培养基均应在洁净的普通冰箱内保存，以2-8℃左右为宜，不得冻结。

2）保存时限:

基础培养基应在30天内用完。

鉴别培养基应在21天内用完。

选择性分离鉴别培养基制成平板后当日用完,置保鲜膜（袋）密闭保存期限可延长至一周。

从外单位购买的培养基保存时限按照产品标注的时限执行.

4．4培养基批号的的管理

培养基的批号由6位阿拉伯数字组成，批号为年、月、日，各取2位，年份取后2位，月和日不足2位时，分别在数字前加0，表明是本日配制的批号。

如2004年6月4日配制的培养基，批号为040604。

4.5质量检查

购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查（制备好的培养基经30～35℃培养48小时，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长）、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，经检查合格的该批次培养基方准许使用，否则不准使用，做好检查记录。

。

成品培养培养基的质量控制应包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告

4.5培养基的性能测试

新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试，包括物理指标和微生物指标的测试，根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告，菌株的选择参考SN/T1538.2-2007《培养基制备指南第2部分：

培养基性能测试实用指南》。

4．5．1物理指标控制

1）测试20℃～25℃的pH值

2）琼脂层厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见杂质；

4．5．2微生物污染的控制

从每批制备好的培养基中选取至少一个（或1%）平板或试管，置于35-37℃或按特定标准中规定的温度培养48h应无菌生长，真菌培养基经20～25℃培养72小时候后，应无菌生长。

4．5．3微生物学指标控制

可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法（详见表1-表）对培养基性能进行测试，具体操作方法如下：

（1）生长率

将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中，每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。

1）定量方法

生长率PR的计算：

PR=NS/NO

NS：

从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。

N0：

从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数（该菌落总数应≥100cfu）。

要求：

非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1；每平板（或每试管）的接种水平为10CFU～100CFU。

2）半定量方法

半定量方法采用生态测量技术在平板上划线，平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数G，G值不应超过标准规定的允许范围。

3）定性方法

定性方法采用划线法观察。

①选择性

将浓度为104CFU/mL～106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中，培养基的选择性应达到规定值。

②定量方法

选择因子SF：

SF=DO-DS

DO：

能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度

DS：

能在测试培养基上显示生长的最高稀释度

要求：

非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2；半定量和定量法中，非目标菌应部分或全部被抑制。

③生理生化特性（选择性和特异性）

规定培养基的基本特性，使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性（菌落形态、大小等）和非目标菌的被抑制程度进行测试。

（2）性能评价和结果解释

按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定，则该批培养基品质优良；若只有物理指标和微生物指标符合规定，则该批培养基可被接收。

表1计数用选择性培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

参考培

养基

控制方法

判定标准

特征反应

Baird-

Parker

[S]

生长率

37℃24-48h

金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923

TSA

定量

PR≥0.5

黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外有透明带

选择性

37℃48h

大肠杆菌ATCC25922/8739

——

定性

全部抑制

——

特异性

37℃24-48h

表皮葡萄球菌ATCC12228

——

定性

——

黑色/灰色菌落，周围为一混浊带，其外无透明带

MYP

[S]

生长率

30℃24-48h

腊样芽胞杆菌ATCC11778

TSA

定量

PR≥0.7

具沉淀带的粉色菌落

选择性

37℃48h

大肠杆菌ATCC25922

——

定性

全部抑制

——

特异性

37℃48h

枯草芽胞杆菌ATCC6633

——

定性

——

不具沉淀带的粉色菌落

培养基

用途

培养条件

测试菌株

参考培

养基

控制方法

判定标准

特征反应

VRBG（结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂）

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

定量

PR≥0.5

带有或不带沉淀带的粉红色或红色菌落

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

选择性

37℃20h

粪链球菌ATCC29212/19433

——

定性

全部抑制

——

VRBL（紫红胆汁乳糖）

[S]

生长率

30℃20h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

定量

PR≥0.5

带有或不带沉淀带的淡紫色菌落

选择性

30℃20h

粪链球菌ATCC29212/19433

——

定性

全部抑制

——

特异性

30℃20h

铜绿假单胞菌ATCC27853

——

定性

--

无色至浅棕色菌落

CT-SMAC（改良山梨醇麦康凯琼脂）

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌O157：

H7

ATCC43894/43895

TSA

定量

PR≥0.5

透明菌落，表面淡黄棕色，菌落直径约1mm

选择性

37℃24h

金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923

定性

全部抑制

——

特异性

37℃24h

大肠杆菌ATCC11775/25922

——

定性

——

粉色菌落

BGBLB（煌绿乳糖胆盐肉汤）

[L]

生长率

30℃24-48h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

半定量

浊度2+，导管1/3产气

产气并浑浊

弗氏柠檬酸杆菌

ATCC25922/8739

选择性

粪链球菌ATCC29212/19433

定性

不生长

——

EC

[L]

生长率

44℃24～48h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

浊度2+，导气管1/3产气

产气并浑浊

选择性

44℃24～48h

铜绿假单胞菌ATCC27853b

——

定性

不生长

——

EC-MUG/

LS-MUG

[L]

生长率

44℃24～48h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

浊度2+，导气管1/3产气

产气并浑浊，产生荧光

选择性

44℃24～48h

铜绿假单胞菌ATCC27853b

——

定性

不生长

——

乳糖胆盐发酵培养

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

导气管1/3产气

产气并变黄色

选择性

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

——

定性

——

不产气、仍为紫色

LST（月桂酸肉汤）

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

——

半定量

导气管1/3产气

——

选择性

37℃24h

福氏志贺氏菌CMCC51572

——

定性

——

——

表2计数用非选择性培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

参考培

养基

控制方法

判定标准

特征反应

PCA（平板计数琼脂）

[S]

生长率

30℃72h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA

定量

PR≥0.7

——

金黄色葡萄球菌ATCC6538

枯草芽孢杆菌ATCC6633

表3选择性增菌培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

EE

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

半定量

VRBG上＞10CFU

粉红至红色菌落，有或没有沉淀带

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

选择性

粪肠球菌ATCC29212

全部抑制

RVS

[L]

生长率

41.5℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

半定量

XLD或其他选择性培养基上＞10CFU

——

肠炎沙门氏菌ATCC13076

铜绿假单胞菌ATCC27853

选择性

41.5℃24h

大肠杆菌ATCC25922

半定量

TSA上全抑制

——

粪链球菌

ATCC29212

TSA上＜10CFU

SC（亚硒酸盐胱氨酸）

[L]

生长率

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

半定量

XLD或其他选择性培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

+大肠杆菌ATCC25922

+铜绿假单胞菌ATCC27853b

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

半定量

TSA上＜10CFU

——

粪链球菌

ATCC29212

TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）

[L]

生长率

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

半定量

XLD或其他选择性培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

伤寒沙门菌CMCC50071

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

TSA上＜10CFU

——

碱性蛋白胨水

[L]

生长率

37℃24h

霍乱弧菌CMCC16109

半定量

TCBS或其他选择性培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

副溶血性弧菌CMCC20001

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

TSA上＜10CFU

——

福氏志贺氏菌CMCC51572

7.5%氯化钠肉汤[L]

生长率

37℃24h

金黄色葡萄球菌ATCC6538

半定量

B-P平板或其他培养基上＞10CFU

不同培养基上菌落特征不同（见标准）

表4非选择性增菌培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

BHI

生长率

37℃24h

金黄色葡萄球菌ATCC6538

定性

浊度1～2

——

蛋白胨盐

[L]

稀释

20～25℃45min

大肠杆菌ATCC25922

定量

+/-50%菌落数/至（+/-50%原始菌落数

——

金黄色葡萄球菌ATCC25923

表4非选择性增菌培养基（续）

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

乳糖蛋白胨肉汤

[L]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

——

定性

导气管1/3产气

选择性

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

——

定性

——

SCDLP液体培养基

[L]

生长率

37℃24h

铜绿假单胞菌ATCC27853

定性

浊度1～2

——

大肠杆菌ATCC25922

金黄色葡萄球菌ATCC6538

液体沙氏培养基[L]

生长率

26℃5天

白色念珠菌CMCC98001

定性

浊度1～2

——

真菌培养基[L]

生长率

26℃5天

白色念珠菌CMCC98001

定性

浊度1～2

——

表5选择性分离培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

亚硫酸酸铋琼脂（BS）

[S]

生长率

37℃48h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

（2）

菌落呈黑色，有金属光泽

福氏志贺氏菌CMCC51572

菌落呈棕色

选择性

大肠杆菌ATCC25922/8739

全部或部分抑制（0～1）

无典型菌落

粪链球菌ATCC29212/19433

全部抑制（0）

--

XLD

[S]

生长率

37℃24h

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

（2）

菌落呈黑色

福氏志贺氏菌CMCC51573

菌落呈无色

选择性

大肠杆菌ATCC25922/8739

全部或部分抑制（0～1）

无典型菌落

粪链球菌ATCC29212/19433

全部抑制（0）

--

血琼脂平板

[S]

生长率

37℃24～48h

金黄色葡萄球菌ATCC6538/25923

定性

良好生长

β溶血，透明溶血环

粪链球菌ATCC29212

定性

良好生长

α溶血,草绿色溶血环

TCBS

[S]

生长率

37℃24～48h

霍乱弧菌CMCC16109

定性

良好生长

菌落较大，呈黄色

副溶血性弧菌CMCC20001

定性

良好生长

菌落较大，呈绿色

4号琼脂

[S]

生长率

37℃24～48h

霍乱弧菌CMCC16109

定性

良好生长

菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色

非O1群霍乱弧菌CMCC17045

定性

良好生长

菌落较大、扁平透明、湿润、中心带有黑色

选择性

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

定性

全部或部分抑制（0～1）

——

表5选择性分离培养基（续）

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

伊红美兰琼脂

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922/8739

定性

良好生长

菌落紫黑色带金属光泽

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

菌落灰白色半透明

福氏志贺氏菌CMCC51573

定性

良好生长

菌落灰白色半透明

TSI（三糖铁琼脂）

[S]

生长率

37℃24-48h

大肠杆菌ATCC25922/8739

定性

良好生长

斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性

普通变形杆菌

CMCC49001

定性

良好生长

斜面及底层均变黄，产气，硫化氢阳性

福氏志贺氏菌CMCC51573

定性

良好生长

底层变黄，斜面变红，不产气，硫化氢阴性

鼠伤寒沙门菌ATCC14028

定性

良好生长

底层变黄，斜面变红，产气，硫化氢阳性

表6非选择性分离培养基

培养基

用途

培养条件

测试菌株

控制方法

判定标准

特征反应

营养琼脂

[S]

生长率

37℃24h

大肠杆菌ATCC25922

定性

良好生长

（2）

--

鼠伤寒沙门菌ATCC14028c

小肠耶尔森氏菌ATCC23715

8.管理

8.1.贮存培养基的冰箱（或冰柜）内不得存放食品、饮料等无关物品。

8.2.使用前，须仔细检查培养基外观和效期，管理员应按规定的时间检查制备好的培养基的外观：

如失水、沉淀、过期、棉花塞松弛或脱落等异常情况，

如发现失水、沉淀等异常情况，则同一批号剩余的所有培养基及时全部弃去，不得再用

8.3.对于过了效期、瓶塞松驰或脱落的培养基一旦发现立即弃去。

9、记录

商品化培养基/成品培养基目录清单

培养基试剂入库登记表

培养基配制记录

培养基质量控制性能测试记录及评估报告

培养基标签

培养基制备用水检测记录

10引用标准

10.1GB/T27405-2008.实验室质量控制规范食品微生物检测[S].

10.2SN/T1538.1-2005.培养基制备指南第1部分：

实验室培养基制备质量保证通则[S].

10.3SN/T1538.2-2007.培养基制备指南第2部分：

培养基性能测实用指南[S].