高病原性家禽流行性感冒检验方法.docx

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高病原性家禽流行性感冒检验方法

高病原性家禽流行性感冒檢驗方法

壹、前言

高病原性家禽流行性感冒（Highlypathogenicavianinfluenza，以下簡稱HPAI）過去稱為「雞瘟」，是由正黏液病毒科（Orthomyxoviridae）之A型流行性感冒病毒感染所引起。

A型流行性感冒病毒是唯一會自然感染禽鳥類的正黏液病毒。

許多禽鳥類對家禽流行性感冒（以下簡稱為AI）病毒具有感受性。

水禽為保毒宿主，而水禽帶原病毒對雞及火雞大多為低病原性。

病毒之核蛋白衣（Nucleocapsid，以下簡稱為NP）和基質蛋白（Matrixproteins，以下簡稱為MP）為流行性感冒病毒型別相關抗原，血球凝集素（Hemagglutinin，以下簡稱H）及神經胺酸酶（Neuraminidase，以下簡稱N）為亞型（Subtypes）分類抗原。

目前有16種H亞型（H1～H16）及9種N亞型（N1～N9）。

只有H5和H7兩種亞型病毒會對雞、火雞及其他經濟類禽鳥造成HPAI臨床症狀。

大部分H5和H7亞型病毒對家禽為低毒力。

H5或H7病毒都可能突變成高毒力，因此，世界動物衛生組織（OIE）規範所有H5和H7病毒為須通報的家禽流行性感冒（Notifiableavianinfluenza；NAI）。

HPAI感染會依禽鳥的品種及年齡、病毒株的特性及環境因子，而呈現不同的臨床症狀。

高感受性鳥類可能呈現無臨床症狀而猝死或呈現不一嚴重度之臨床症狀，例如結膜炎、鼻炎、咳嗽、噴嚏、呼吸困難、顏面腫脹、沉鬱、警覺性降低、顯著減少飲水及攝食、雞冠、肉垂及腳鱗皮膚發紺、神經症狀及下痢等。

產蛋雞會有明顯的產蛋量下降，品質不良蛋增加。

典型的HPAI常呈現高發病率及急速上升之死亡率。

低病原性家禽流行性感冒（Lowpathogenicavianinfluenza，以下簡稱LPAI）通常只造成輕微或無臨床症狀，但在某些情況下會產生嚴重的臨床症狀而誤以為是HPAI。

HPAI之確診係依據所分離出病毒之病原性鑑定，但在特殊情況下，可分析檢體中病毒血球凝集蛋白（以下簡稱為HA0）切割位之胺基酸序列，以達到確診的目的。

檢測疑患禽鳥的血清抗體可做為輔助診斷，不適合用於確診。

當有疫情發生時，為了防疫需求以儘速控制疾病，診斷可以依分子檢測結果（例如HA0切割位之胺基酸序列呈現HPAI病毒特徵），加上H亞型檢測的結果來判定。

病原性的鑑定係以接種無特殊病原（Specificpathogenfree，以下簡稱SPF）或家禽流行性感冒（以下簡稱AI）抗體陰性（Specificantibodynegative，以下簡稱SAN）雞隻的靜脈接種致病指數（Intravenouspathogenicityindex，以下簡稱IVPI）或接種雞隻死亡率為其黃金準則。

IVPI大於1.2或接種雞隻死亡率大於75%者判定為HPAI，IVPI低於1.2之H5及H7亞型須進一步分析其HA0切割位胺基酸序列，若HA0切割位的胺基酸序列與其他HPAI分離株的序列相似者，須考慮該病毒具有發展成HPAI的潛勢，爰判定為HPAI。

貳、實驗室檢驗

一、病毒檢驗

（一）採取病材

１、病材採取之品質好壞及其保存與輸送的狀況，密切影響AI病毒之分離及診斷結果。

採樣以發生臨床症狀三日內所得之病材檢測效果最佳。

２、死禽：

死禽採取全身各組織臟器，包括氣管、肺、腸、脾、胰、腎、腦、肝及心臟等，病材可分開或混合處理。

３、活禽：

活禽採取喉頭氣管拭子和共泄腔拭子，幼小個體禽類不易採集者，則採新鮮排遺取代之。

採取之拭子保存於含有抗生素的磷酸緩衝液（Phosphatebuffersaline；以下簡稱PBS）或含有蛋白質及抗生素的輸送培養液內。

輸送培養液係由細胞培養液（Minimumessentialmedium；MEM）或PBS或tryptose-phosphatebroth（TPB）或腦心浸出液（Brain-heartinfusion；BHI）等為基礎液，再加0.5～1%牛血清白蛋白或明膠（Gelatin）及抗生素（具有保護病毒及抑制細菌之效果）。

４、輸送與保存：

採集之病材應馬上以低溫冷藏方式輸送至檢測實驗室或存放於4℃最多4天。

需長期保存之診斷病材應存放於-80℃，避免重覆解凍。

若以乾冰保存或輸送則需將病材密封，以防二氧化碳之滲入，致pH值降低而造成病毒不活化。

（二）病毒分離

　　分離AI病毒需用SPF或SAN的雞胚胎蛋為接種材料。

１、病材處理：

（１）喉頭氣管拭子及共泄腔拭子試管以震盪器混合均勻後靜置備用。

（２）組織病材與輸送培養液混合研磨成10%（W/V）乳劑，處理完成之病材乳劑於室溫中1～2小時內儘速接種完成，若放於4℃僅能保存數天，否則應存放於-80℃。

（３）上述（１）（２）經1,000g離心10分鐘，取上清液供接種用。

２、雞胚胎接種：

喉頭氣管拭子、共泄腔拭子或組織乳劑上清液接種於9～11日齡SPF或SAN雞胚胎蛋的尿囊腔內。

每批病材接種至少5個蛋，每個蛋接種0.1～0.2mL。

接種後，將蛋放在35～39℃恆溫箱中培養2～7天。

３、收集病毒液：

收集病毒液前先將蛋冷卻於4℃4小時或隔夜，待蛋內血管收縮後，抽取尿囊液。

並以血球凝集試驗進行篩檢，如果沒有血球凝集性，該尿囊液應至少再盲目接種一代；如果有血球凝集性且無細菌污染，表示可能有A型流感病毒或禽類副黏液病毒之存在，需進一步以瓊膠免疫沉降法（Agargelprecipitation；以下簡稱AGP）或反轉錄聚合酶鏈反應（Reversetranscriptase-polymerasechainreaction，以下簡稱RT-PCR）等方法鑑定病毒型別，再以血球凝集抑制法、神經胺酸酶抑制法或RT-PCR等方法鑑定亞型。

４、核酸鑑定：

使用如RT-PCR、即時反轉錄聚合酶鏈反應（Real-timeRT-PCR）、反轉錄恆溫環形核酸增幅法（RT-Lamp）等以分子為基礎的鑑定技術，配合引子或探針的特異性進行檢驗，或比對基因序列，以達鑑定病原之目的（相關操作如參考文獻４～７）。

（三）以血球凝集抑制法（Hemagglutinationinhibition；以下簡稱HI）鑑定病原亞型：

　　基於AI病毒的H蛋白具有血球凝集（以下簡稱HA）特性，用已知H亞型之抗血清進行HI法來鑑定病毒之H亞型。

首先需儲備AI病毒亞型之標準抗原和抗血清（詳見附錄1），HI法使用之紅血球取自SPF或SAN雞隻的血液。

HI試驗前需先測定抗原之力價，以定量的4HA單位抗原來執行HI檢測。

１、對照抗原和分離株HA力價測定：

（１）以96孔微量測定盤進行試驗。

（２）分裝25μLPBS至第2～第12孔（A～H列）。

（３）第1孔（A1～F1）分別加50μL分離株病毒液或對照抗原。

G及H列的第1孔不加抗原液。

（４）H列作為血球對照用，所以H列第1孔加50μLPBS。

（５）由第1孔開始進行25μL兩倍連續序列稀釋，稀釋之最後一孔丟棄25μL。

（６）再加25μLPBS至每一孔。

（７）全盤每孔加25μL之1%雞紅血球懸浮液。

（８）輕拍盤子使混合均勻，在室溫中放置約40分鐘，見血球對照孔之血球完全沉降下來即可判讀及記錄。

（９）血球與病毒（或抗原）完全凝集記為”＋”，不完全凝集記為”＋/－”，血球完全沉降者記為”－”。

將盤子傾斜，觀察血球淚滴狀流下，流下之速度與血球對照相同者表示血球完全沉降。

完全凝集之病毒（或抗原）最高稀釋倍數，即代表病毒（或抗原）之HA力價。

２、製備HI試驗用標準抗原液及迴歸力價測定：

（１）先計算進行HI試驗所需4HA單位（4HAU）抗原液總量後，將已知力價之病毒（或抗原）以PBS稀釋為4HAU/25μL濃度，置於4℃備用，稀釋好的抗原液僅限於當日使用。

（２）製備好的4HAU抗原液再次進行HA試驗，迴歸檢測以確定製備之抗原液力價，檢測結果應在前三孔呈現HA。

如果力價不對，HA多一孔則再將抗原等量稀釋二倍，HA少一孔則需再加入等量的抗原，使抗原濃度增加一倍。

３、血球凝集抑制試驗（鑑定野外株病毒）：

（１）分裝25μLPBS至B～H列的第1～12孔。

（２）分別加50μLH1～H15標準抗血清至A排各孔。

（３）由第1孔開始進行25μL兩倍連續序列稀釋，稀釋之最後一孔丟棄25μL。

（４）每孔加入25μL4HAU病毒或抗原，在室溫感作15分鐘。

（５）每孔再加25μL1%之雞紅血球懸浮液，輕微振盪混勻後，靜置室溫中約40分鐘，見血球對照孔之血球完全沉降下來即可判讀及記錄。

（６）可以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數即為HI力價。

（７）每一血清均採重複二列之序列稀釋，一列供檢測分離株病毒用，一列做為陽性抗原對照用。

（８）最後兩列（G及H列）作為紅血球對照用，以PBS取代血清稀釋及抗原添加。

（９）若有抗原與抗體反應，則血球凝集被抑制。

同樣將盤子傾斜判讀，血球完全凝集記為

       ”＋”，不完全凝集記為”＋/－”，完全抑制凝集記為”－”。

完全抑制凝集之最高血清稀釋倍數，即代表抗體之HI力價。

（１０）假如野外分離株與某一亞型參考血清反應的HI力價大於其他亞型血清4倍以上，則此力價較高者表示為分離株之亞型。

（四）病原性鑑定

　　病原性的鑑定係以接種雞隻的靜脈致病指數（IVPI）或接種雞隻的死亡率為其黃金準則，配合HA0切割位胺基酸序列分析，以評估病毒之病原性。

１、IVPI：

（１）HA力價大於1:

16之新鮮病毒液，以滅菌之生理食鹽水稀釋10倍。

（２）取稀釋之病毒液靜脈接種10隻4～8週齡SPF或SAN雞隻，每隻0.1mL。

（３）每24小時觀察一次，持續10天，在每次觀察時記錄每隻雞之分數：

正常雞記0分、發病雞記1分、嚴重發病記2分、死亡雞記3分（發病程度之判定通則：

出現呼吸症狀、沈鬱、下痢、無毛部皮膚或肉垂發紺、頭或臉水腫及神經症狀等其中一種症狀時，判為”發病”，呈現一種以上症狀時，判為”嚴重發病”）。

死亡之雞隻在死亡之後每日的觀察值皆要記為3分。

（４）IVPI係指10日觀察期間，每天每隻雞之平均分數。

將全部雞隻10日之總分除以100即為IVPI值。

IVPI=3.00表示所有的雞在24小時內死亡；IVPI=0.00表示在10日觀察期間沒有雞隻呈現任何臨床症狀；IVPI值大於1.2者為HPAI。

２、接種雞隻死亡率檢測：

（１）無菌新鮮之病毒尿囊液稀釋10倍。

（２）靜脈接種8隻4～8週齡具感受性雞隻，每隻接種0.2mL，觀察10日。

（３）計算死亡率，當雞隻死亡6、7或8隻時（即死亡率達75%以上），則判定為HPAI。

３、血球凝集蛋白（HA0）切割位胺基酸序列分析：

　　所有H5或H7病毒株其IVPI小於1.2或接種雞隻死亡率小於75%者，都須再進行本方法分析該病毒的HA0切割位胺基酸序列，若序列與其他HPAI分離株相似，則判定為HPAI。

　　本法旨在分析H5和H7亞型AI病毒HA0核酸序列，而推演出對應的胺基酸序列。

最常使用的方法是RT-PCR，即在切割位兩端序列設互補引子（引子序列參見附錄2），進行循環序列分析。

可依商品化套組之建議設定過程中不同的條件，並以自動化序列分析儀分析。

（１）病毒RNA萃取（或依商品化套組之建議操作）

Ａ、病毒液200μL加入1mL核酸萃取液（Trizol），混合均勻後，靜置室溫5分鐘。

Ｂ、加200μL氯仿（Chloroform），混合後，靜置室溫3分鐘，12,000rpm離心15分鐘。

Ｃ、取分離層之上層600μL於另一新試管內，加入600μL異丙醇（Isopropanol），混合均勻，靜置室溫10分鐘，12,000rpm離心20分鐘。

Ｄ、倒掉上清液，加入75%酒精1mL，混合後再於12,000rpm離心5分鐘。

Ｅ、輕輕倒掉上清液，並用微量吸管小心抽掉其餘酒精，靜置數分鐘使殘餘之酒精揮發。

Ｆ、加入100μL含DEPC（Diethylpyrocarbonate）處理過的蒸餾水，以微量吸管將病毒RNA溶解均勻。

Ｇ、待用時置放於4℃，否則保存於-20℃。

（２）cDNA合成（或依商品化套組之建議操作）

Ａ、取4μLRNA及陰性對照管（管內放水）加0.5μLprimer’Uni-12’。

Ｂ、 72℃作用5分鐘後。

Ｃ、 加入預先調配好之cocktail合成反應液，每管5.5μL。

Ｄ、 全量10μL混合均勻，在42℃作用1小時。

Ｅ、 95℃5分鐘使RT反應停止。

（３）PCR反應（或依商品化套組之建議操作）

Ａ、每管取1.5μLcDNA加入48.5μLPCR反應液。

Ｂ、將試管放在溫度循環器內，設定增幅條件：

（４）PCR產物電泳

Ａ、將agarose電泳膠放入電泳槽內，倒入1xTBE緩衝液，蓋過膠片。

Ｂ、取4μLPCR產物，混以3μLloadingbuffer。

Ｃ、加4μL分子量標示物於電泳膠第一孔。

Ｄ、取7μLPCR產物、陽性對照和陰性對照，分別加入電泳膠的不同孔中。

Ｅ、蓋上電泳槽蓋子，設120V電壓跑30-40分鐘。

Ｆ、最後在302nm波長之紫外光下觀察分子標示物及PCR產物，並比較分子量大小。

（５）PCR產物定序

　　若經電泳分析PCR產物分子量大小無誤，則取此特異性片段產物利用自動核酸序列分析儀進行定序反應，核酸序列分析結果以電腦序列分析軟體自動轉換為胺基酸序列後，讀取檢測毒株之HA0切割位胺基酸序列。

（６）判讀

　　HA0切割位胺基酸序列如果和已知高病原性病毒之序列相似，即判定為HPAI。

二、血清學檢測

（一）酵素連結免疫吸附分析（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay；ELISA）

　　一般市售商品化ELISA抗體檢測套組無法檢測AI抗體亞型，只能證實有A型流行性感冒的抗體存在，操作依套組使用說明使用。

（二）以瓊膠免疫沉降法（AGP）檢測抗體：

　　所有A型流行性感冒病毒均具有相似的NP及MP抗原，而本法利用抗原／抗體在高濃度鹽類之瓊膠內移動擴散產生抗原／抗體沉降線反應，檢測血清中有無A型流行性感冒病毒之特異性抗體。

１、抗原製備：

以AI病毒接種10日齡SPF雞胚胎蛋後，取其絨毛尿囊膜研磨成均質化，再經反覆冷凍解凍三次後，以1,000g離心10分鐘，取上清液添加0.1%福馬林或1%betapropiolactone使病毒不活化，再離心一次之上清液即為AGP抗原使用。

以本法製備之抗原主要為NP抗原。

２、瓊脂盤製備：

泡製1%（w/v）agarose（如附錄三之九）或純化的agar與8%（w/v）氯化鈉溶於PBS內，加熱溶解，倒20mL至9cm平皿內，使用孔徑5mm孔間距為2-5mm的孔型打洞後挖除洞中之瓊脂。

３、方法：

每孔加入50μL試劑，每個測試血清緊鄰已知陽性血清和抗原，如此才能確定測試血清與NP抗原間產生的沉降線和已知陽性沉降線是否連續吻合。

加完試劑後，瓊脂盤放入密封容器內，再放入一塊濕棉花以保持容器內溼度，放室溫中。

４、判讀：

約24-48小時後檢查沉降線，在暗視野有背光之下觀察，當測試孔與抗原間產生了沉降線，且與陽性對照線連成連續性的吻合線則判為特異性陽性。

若為交叉線則表示測試血清與陽性對照血清的抗體不同，應判為陰性。

（三）血球凝集抑制（HI）抗體檢測

　　以AGP或ELISA法檢測為AI抗體陽性之血清，可依需要以HI方法來鑑別其是否為H5或H7亞型抗體。

其執行方法如前所述，預備H5或H7標準株或已知H5或H7野毒株做為本檢測用抗原，檢測結果抗體力價1:

16或以上判為陽性，抗體力價1:

4至1:

8為疑陽性，需增加血清樣本數加以檢測，並配合其他臨床症狀、肉眼病變及病毒學發現才可以下診斷。

參、綜合判定準則

我國自2004年以來家禽場已存在H5N2LPAI病毒，近年來除了LPAI病毒外，由基因序列演化分析也證實HPAI病毒存在雞群中。

在LPAI與HPAI病毒共同於雞群中存在的現象，增加檢驗及診斷的複雜性與困難度。

在此情況下，疑患場雞群臨床上不一定會出現HPAI典型的臨床症狀、高發病率及高死亡率現象，故單以臨床觀察為依據易喪失防疫先機。

面臨如此複雜的診斷案例，為了掌控防疫先機，對於需通報的HPAI及LPAI之診斷判定依據以下規範辦理：

一、高病原性家禽流行性感冒（HPAI）:

　　參酌世界動物衛生組織（OIE）對於HPAI之認定依據，符合以下二項條件之一者即判定為HPAI：

（一）接種雞隻死亡率大於75%或IVPI大於1.2。

（二）HA0切割位胺基酸序列相似於其他HPAI病毒株序列（參考附錄4所列國際已知HPAI之HA0切割位胺基酸序列及附錄5我國已發生HPAI之HA0切割位胺基酸序列）。

　　我國已發生之H5N2病毒HPAI的HA0切割位胺基酸序列至目前止，包括-RKKR-及-RRKR-兩種，因此疑患禽場之臨床病材可直接經由核酸檢測確定H5亞型，經過定序後，若確定HA0切割位序列為-RKKR-或-RRKR-，即判定為HPAI。

二、需通報之LPAI：

　　所有非HPAI之H5或H7病毒株皆屬之。

臨床病材經病毒分離或核酸檢測發現為H5或H7亞型病毒或核酸，經HA0切割位序列分析沒有符合已知HPAI切割位序列者；

（1）當切割位未具有-BXBR-（B表示鹼性胺基酸R或K）特性之H5或H7亞型，得以切割位結果直接判定為需通報之LPAI（註1）；

（2）當切割位具有-BXBR-特性時需再補行IVPI或接種雞隻死亡率檢測，檢測結果IVPI小於1.2或死亡率小於75%者判定為需通報之LPAI。

但如果此-BXBR-序列與國內往例判定之LPAI的切割位序列相似時，得直接判定為需通報之LPAI（註2）。

註1：

例如野鳥及水禽常見之LPAI病毒株，其HA0切割位序列只有1至2個鹼性胺基酸，未具-BXBR-特性。

註2：

例如H5亞型之-REKR-（3個鹼性胺基酸）。

肆、參考文獻

１、AustralianStandardDiagnosticTechniquesforAnimalDiseases.StandingCommitteeonAgricultureandResourceManagement.Victoria,Australia.1993.

２、ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals2011.Chapter2.3.4Avianinfluenza（NB:

VersionadoptedinMay2009）.

３、WHOManualonAnimalInfluenzaDiagnosisandSurveillance.GlobalInfluenzaProgramme,WorldHealthOrganization,DepartmentofCommunicableDiseasesSurveillanceandControl,Switzerland.2002.

４、LeeMS,ChangPC,ShienJH,ChengMC,ShiehHK.Identificationandsubtypingofavianinfluenzavirusesbyreversetranscription-PCR.JVirolMethods.2001Sep;97（1-2）:

13-22.

５、YoshidaH,SakodaY,EndoM,MotoshimaM,YoshinoF,YamamotoN,OkamatsuM,SoejimaT,SenbaS,KandaH,KidaH.Evaluationofthereversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification（RT-LAMP）asascreeningmethodforthedetectionofinfluenzavirusesinthefecalmaterialsofwaterbirds.JVetMedSci.2011Jun;73（6）:

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７、QiuBF,LiuWJ,PengDX,HuSL,TangYH,LiuXF.Areversetranscription-PCRforsubtypingoftheneuraminidaseofavianinfluenzaviruses.JVirolMethods.2009Feb;155

（2）:

193-8.

附錄1

　　　　　　　　　　　　家禽流行性感冒（AI）診斷鑑定用參考亞型株

亞型

　　　　　　　病毒株

H1

A/PR/8/34（H1N1）

H2

A/Singapore/1/57（H2N2）

H3

A/duck/Ukraine/1/63（H3N8）

H4

A/duck/Czech/56（H4N6）

H5

A/duck/HongKong/820/80（H5N3）

H6

A/shearwater/Australia/1/72（H6N5）

H7

A/duck/HongKong/301/78（H7N1）

H8

A/turkey/Ontario/6118/68（H8N4）

H9

A/turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）

H10

A/chicken/Germany/N/49（H10N7）

H11

A/duck/Memphis/546/74（H11N9）

H12

A/duck/Alberta/60/76（H12N5）

H13

A/gull/Maryland/704/77（H13N6）

H14

A/mallard/Australia/263/82（H14N5）

H15

A/shearwater/W.Aus./79（H15N8）

附錄2

　　　　　　　　　　　　　　RT-PCR使用之寡核苷引子參考序列

Primer　序列

Primer　認別位置

AGCAAAAGCAGG

Uni-12（1-12）

GGAGACTCAGCAATCCCATGAAAG

H5-775f（775-798）

CCATACCAACCGTCTACCATTCC

H5-1021