HPLCDADMS MS 法用于止咳平喘类中成药中添加14 种肾上腺皮质激素的筛查和定量讨论Word格式.docx

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利用谱库进行精确质量数检索和多级碎片离子确证，一次进样可完成多种成分的筛查，提高了特殊情况下的应急检验能力和工作效率。

　　1仪器与试药

　　Agilent1200高效液相色谱仪（配有DAD检测器）;

6320IonTrapLC/MS;

KQ-500DE型数据超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），频率40kHz，功率500W。

甲醇、乙腈为色谱纯（Burdick&

Jackson）;

甲酸铵为分析纯（Sigma-Aldrich）;

纯化水用MilliporeQ纯化系统制备。

　　对照品曲安西龙（批号100333-200201）、地塞米松磷酸钠（批号0016-9610）、泼尼松（批号100199-199401）、氢化可的松（批号100152-200206）、地塞米松（批号100129-200303）、曲安奈德（批号0055-9501）、醋酸泼尼松龙（批号100124-200303，含量99.2%）、醋酸氢化可的松（批号100013-200106）、醋酸泼尼松（批号100012-200706）、醋酸可的松（批号100123-200303，含量99.2%）、丁酸氢化可的松（批号100303-200101）、醋酸氟轻松（批号0010-9305）、丙酸氯倍他索（批号100302-200602）、丙酸倍氯米松（批号100119-200603）由中国食品药品检定研究院提供。

阴性样品1为克咳胶囊，贵州益佰制药股份有限公司;

阴性样品2为麻杏止咳片，山西亚宝药业集团股份有限公司;

阴性样品3为喘舒片，山东鲁泰环中制药有限公司;

阴性样品4为止咳丸，昆明中药厂有限公司;

阴性样品5为蛇胆川贝液，湖北纽兰药业有限公司。

　　阳性样品假药A为复方咳喘灵胶囊，标示生产单位为河南省台前县侯庙乡白楼村;

假药B为川羚定喘灵胶囊，标示生产单位为河南省台前县清水河西大街328号;

假药C为复方川羚定喘胶囊，标示生产单位为河南省台前县哮喘病研究所;

假药D为神奇喘咳散，无标示生产单位。

以上阳性样品均由山东省食品药品监督管理局提供。

　　2方法与结果

　　2.1分析条件

　　2.1.1色谱条件色谱柱:

VenusilMPC18（4.6mm×

250mm，5μm）;

流动相:

以乙腈-甲醇（1∶1）为流动相A，以甲酸铵溶液（取甲酸铵0.3g，加水1000mL溶解）为流动相B，进行梯度洗脱[0～25min，流动相A-B由15︰85逐渐变为45︰55，并保持25min;

50～90min，流动相A-B逐渐变为85︰15，并保持10min];

流速:

1mL·

min-1;

检测波长:

240nm;

参比波长:

360nm;

波长扫描范围:

190～400nm;

柱温:

30℃;

进样量:

10μL。

　　2.1.2质谱条件质谱装配电喷雾电离源（ESI）。

干燥气温度:

325℃;

干燥气流速:

5L·

min-1;

雾化压力:

0.1MPa;

分流比10∶1;

扫描方式:

正、负离子同时一级、二级质谱全扫描;

扫描的质量范围:

m/z50～600。

　　2.2溶液的制备

　　2.2.1混合对照品溶液精密称取曲安西龙、醋酸泼尼松、醋酸可的松约2mg，醋酸泼尼松龙、醋酸氟轻松、丁酸氢化可地松约6mg，其余对照品各约3mg，置100mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备溶液;

精密量取储备溶液5.0mL，置25mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

　　2.2.2供试品溶液、阴性溶液和质控（QC）样品溶液取1次口服剂量胶囊剂内容物、片剂、丸剂等固体制剂，研细，置100mL量瓶中，加甲醇50mL，超声10min并时时振摇，取出，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过。

精密量取续滤液5.0mL，置25mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液;

或取1次口服剂量的口服液，置100mL量瓶中，同法制备供试品溶液。

取阴性样品1～5，按供试品溶液的制备方法，制备阴性溶液1～5。

取相当于制备供试品溶液样品量的阴性样品分别加入曲安西龙、醋酸泼尼松、醋酸可的松约2mg，醋酸泼尼松龙、醋酸氟轻松、丁酸氢化可地松约6mg，其余对照品约3mg，按供试品溶液的制备方法，制备质控（QC）样品溶液1～5。

　　2.3方法学考察

　　2.3.1专属性试验分别取对照品溶液、阴性溶液、质控（QC）样品溶液进样，按色谱峰保留时间和DAD图谱为判断指标，阴性样品检测结果为阴性，质控（QC）样品均检测出14种成分。

　　2.3.3紫外吸收图谱最大吸收处的波长与检出限取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，逐步稀释，按[M+H]+（EIC）峰面积S/N≥3计算检出限。

各成分紫外吸收图谱最大吸收处的波长和检出限结果。

　　2.3.4线性关系和范围精密量取“2.2.1”项下的混合对照品储备溶液0.2、0.4、0.6、1.0、2.0、3.0、5.0和6.0mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成标准系列溶液，分别进样10μL，以进样浓度（X，μg·

mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

　　2.3.5精密度试验取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，14个肾上腺皮质激素保留时间的RSD均小于0.5%，峰面积的RSD均小于2.0%，各色谱峰DAD特征图谱最大吸收波长变动小于±

2nm。

　　2.3.6回收率试验按“2.2.2”项下质控（QC）样品溶液的制备方法，以“2.2.1”项下的混合对照品溶液的浓度为基础（100%），分别配制高（150%）、中（100%）、低（50%）3种浓度质控（QC）样品溶液（n=3）对5种剂型质控（QC）样品进行回收率考察。

　　2.3.7稳定性试验取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，于0、6、12、24、48h每个时间点均连续进样6次，14个肾上腺皮质激素保留时间测定值的相对标准偏差均小于0.5%、峰面积测定值的相对标准偏差均小于2.0%，各色谱峰DAD特征图谱最大吸收波长变动在±

2nm内。

　　3样品分析

　　3.1实验室常规筛查和检测

　　按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以色谱峰保留时间和DAD特征吸收图谱最大吸收波长为判断指标，假药A高效液相色谱图中，约在60.78min出现的色谱峰，在240nm波长处有最大吸收，与对照品醋酸泼尼松一致，初步判断含醋酸泼尼松，以本法测定每粒含2.3mg;

按相同的判定方法，假药B检出醋酸泼尼松，每粒含2.8mg，假药C检出醋酸泼尼松，每粒含2.1mg;

假药D检出醋酸泼尼松，每包含12.5mg。

　　3.2质谱验证试验

　　在与对照品相同的色谱及质谱条件下，对供试品溶液进行MS和MS-MS分析。

在样品中检测到与醋酸泼尼松对照品相同保留时间的杂质，经MS扫描，假药A检出[M+H]+离子（m/z401.8，60.9min）及MS2离子（m/z383.1）与醋酸泼尼松对照品[M+H]+离子（m/z401.1，58.6～58.9min）、MS2离子（m/z383.0）一致。

准分子离子与对照品相同，对准分子离子进行二级全扫描质谱分析，产生与对照品一致的碎片离子，进一步对杂质的定性提供了确证依据。

　　4讨论

　　4.1阴性样品的选择

　　为使检测方法具有通用性，从市场抽到30个品种共46批止咳平喘类中成药，对该类药物剂型和处方进行调研。

其中胶囊剂13个品种，片剂10个品种，丸剂3个品种，口服液体制剂3个品种，冲剂1个品种，处方共包含50多味药材。

选定的5批阴性样品为市场上常见止咳平喘中成药，剂型包括胶囊、片剂、丸剂和口服液，处方中含止咳平喘中成药中常出现的麻黄、甘草、桔梗、苦杏仁、罂粟壳等20多味药材，阴性样品具有代表性。

　　4.2专属性试验

　　中药成分复杂，由于肾上腺皮质激素类非法添加物剂量不确定，基质干扰大，容易出现假阳性或假阴性结果，给检测工作带来难度。

为此，着重进行专属性试验，对阴性和质控（QC）样品进行考察。

比较色谱与质谱图，阴性溶液液相色谱图未见与14种对照品保留时间一致的色谱峰，未发现一级质谱准分子离子峰，质控（QC）样品1～5均检测出14种添加成分，建立的方法专属性良好。

　　4.3流动相和检测波长

　　止咳平喘中成药处方成分复杂，为减小背景干扰，筛选了甲醇-乙腈-0.3%甲酸铵溶液流动相系统，并采用梯度洗脱方式，较好地排除了背景成分的干扰，各成分分离度好，背景对待测成分干扰小。

14种目标物在238～246nm区间有较大吸收，选择240nm为测定波长，待测物均有较大的吸收，提高了检测灵敏度。

　　4.4供试品溶液浓度

　　若供试品溶液浓度过小或过大，待测峰DAD图谱与对照品可能差异较大。

可通过调整供试品溶液的浓度，使待测峰峰面积与对照品的相近，再与对照品DAD图谱进行比较。

　　4.5筛查及确认方法的适用条件

　　建立的高效液相色谱-二极管阵列方法，适用于一般实验室常规筛查和检验。

质谱分析方法，能提供化合物的结构信息，如相对分子质量、特征碎片等，其可靠性高于紫外等光谱分析方法，实验室常规检查结果呈阳性的样品，用质谱方法进行确认。

　　4.6二极管阵列及质谱数据库

　　以对照品各成分顶点吸收光谱作为DAD标准光谱，按Agilent-1200数据工作站操作程序，建立相应的DAD数据库。

以曲安西龙[M+H]+、[M-H]-，地塞米松磷酸钠[M-2Na+3H]+、[M-2Na+H]-特征离子全扫描一级质谱图，建立一级质谱数据库，相应的全扫描二级质谱图建立二级质谱数据库;

其他12种肾上腺皮质激素以[M+H]+特征离子全扫描一级质谱图，建立一级质谱数据库，相应的全扫描二级质谱图建立二级质谱数据库。

对假药A～D的DAD试验数据进行检索，61min左右出现的色谱峰与数据库醋泼尼松标准DAD图谱匹配度分别为996.071、997.608、995.792、999.272（限度900），4批假药均检出醋酸泼尼松。

对假药A～D一级、二级全扫描质谱数据进行检索，检出与质谱数据库中醋酸泼尼松正向、反向匹配度分别为961、961，978、976，979、979，979、975的离子（限度900），4批假药均检出醋酸泼尼松。

与传统的数据处理方法比较，利用数据库的计算机自动分析系统，具有更方便、快捷的优势，利于特殊情况下的应急检验。

　　4.7小结

　　本方法采用HPLC-DAD-MS/MS联用技术，将液相色谱高效的在线分离能力与质谱的强定性能力相结合，可以同时得到待测组分的保留时间、在线紫外光谱及特征结构碎片等质谱信息，增加了分析检测方法的选择性和专属性。

中药成分复杂多样，分离提纯难度大，本方法不需要对样品进行复杂的前处理，回收率、精密度好，灵敏度高，各成分线性关系良好，可用于14种肾上腺皮质激素的同时检测。