谈15HETE 参与的脑缺血再灌注损伤中pERK12 表达变化的研究Word格式.docx

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本文检测脑缺血再灌注中梗死核心区及梗死周围区p-ERK1/2的表达，以探讨p-ERK1/2在15-HETE参与的脑缺血再灌注损伤中的作用。

　　1材料与方法

　　实验材料

　　成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（哈尔滨医科大学实验动物中心提供，230~270g，标准环境饲养）。

NDGA购于Biomol公司;

p-ERK一抗购于CellSignaling公司;

天能凝胶电泳仪（上海天能科技有限公司）;

分析软件采用GIS2010Tanon数码图像处理系统（上海天能科技有限公司）。

动物分组

　　54只大鼠随机分组：

假手术组（sham组）、DMSO对照组、NDGA处理组。

后两组再根据不同的灌注时间分为三个亚组：

再灌注1小时组、再灌注6小时组、再灌注24小时组（每组6只）。

　　局灶性脑缺血再灌注损伤模型的制备

　　根据ZeaLonga线栓法，并做适当改进。

10%水合氯醛（mL/100g）腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧固定在解剖板上，在无菌状态下颈正中切口，钝性分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。

结扎右侧颈外动脉近端及颈总动脉近心端，远心端穿线备用。

用动脉夹夹闭右侧颈总动脉远端。

距颈总动脉分叉2cm处剪一小口，用镊子轻轻将直径mm的尼龙线栓插入，经颈总动脉分叉处入颈内动脉，深入至距分叉处约18mm，直至感觉有阻力时，即阻断右侧大脑中动脉入口处。

拉紧固定栓线的结扎线，按顺序缝合肌肉、皮肤，线拴尾端留于皮肤外以备抽线，梗死2小时后抽出线拴，形成再灌注。

在麻醉缺血2小时和再灌注1小时期间，用40W白炽灯加热维持大鼠的体温。

假手术组仅分离颈总动脉，而不插入线拴。

DMSO对照组给予与NDGA处理组相同体积的DMSO。

NDGA处理组将NDGA（50mg/kg）溶于二甲基亚砜（DMSO），于梗死前30分钟应用腹腔注射的方式处理大鼠。

按Longa法对麻醉清醒后的动物进行神经功能评分，即5分制法。

0分：

无神经损伤症状;

1分：

不能完全伸展对侧前肢;

2分：

向对侧转圈;

3分：

向对侧倾倒;

4分：

不能自发行走，意识丧失。

　　梗死体积百分比测定

　　再灌注24小时后，用10%水合氯醛深度麻醉大鼠，断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部分在-20℃冰箱冷冻20min左右。

将脑从冰箱里取出后，在冰盘上冠状切成5片，每隔2mm切一片。

迅速将脑片置于2%四氮唑红（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，TTC）染液中。

用锡纸盖住后，37℃避光恒温孵育15~30min，使其均匀接触到染色液。

经染色后非缺血区为粉红色，梗死区为白色。

拍照，将数据输入计算机，应用软件Image-ProPlus版分析计算梗死体积，计算出梗死体积占大脑半球体积的百分比。

　　免疫印迹法检测p-ERK1/2的活性

　　将再灌注各时间点少量脑组织块称重后置于1~2mL匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

加裂解液（含PMSF）后充分研磨10~15min。

将裂解后的组织悬液移入Eppendorf离心管中，置于冰浴中，超声粉碎8次，每次2秒。

裂解30min后，4℃下12000rpm离心5min，上清液即为所需蛋白质溶液，分装于mL离心管中。

样品加上loadingbuffer煮沸5min，瞬时离心。

10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，80-120V电泳2小时左右。

将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，200mA转膜约h。

将硝酸纤维素膜（NC）置于封闭液（TBST+5%脱脂奶粉）中，室温封闭1小时将NC膜转移至密封袋中，加入兔抗鼠单克隆p-ERK抗体（稀释浓度为1：

200）4℃过夜（以actin为内参，稀释浓度为1：

1000）。

将膜用TBST冲洗4次，第1次15min，以后每次5min。

将膜转移至密封袋中，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释浓度为1：

1000），室温孵育1小时。

TBST冲洗4次，第1次15min，以后每次5min。

ECL显色3min，曝光1~30min，应用GIS2010Tanon数码图像处理系统分析目标条带的光密度值，进行半定量分析。

统计学分析数据以均数±

标准差（x±

SD）表示，梗死体积百分比测定应用Studentt检验法进行检验，Westernblot检测的p-ERK结果采用方差分析（ANOVA），两组间比较用Student-Newman-Keuls检验，P<

为差异具有统计学意义。

　　2结果

　　梗死体积百分比

　　再灌注24小时DMSO对照组脑梗死体积百分比为±

%，梗死区边缘较整齐;

NDGA预处理组脑梗死体积百分比为±

%，较DMSO组显著减小（P<

），梗死区边缘不整齐。

　　p-ERK1/2的活性

　　由于ERK分为两个亚型，ERK蛋白条带分为两个亚带，分子量为44kD的条带是ERK1，分子量为42kD的条带是ERK2。

假手术组仅有少量p-ERK1/2的表达。

DMSO对照组p-ERK1/2的表达从梗死再灌注后1小时（±

）即开始逐渐升高，6小时（±

）达高峰，24小时（±

）有所下降，与假手术组（±

）比较，P值均<

（图2A，B）。

应用NDGA后，再灌注各时间点p-ERK1/2的表达均下降。

而与梗死核心区（±

）相比较，再灌注24小时梗死周围区（±

）仍可检测到较高含量的p-ERK1/2，但梗死核心区表达相对较少（P=）。

　　3讨论

　　缺血性脑损伤的机制至少涉及到以下几个方面：

兴奋性毒性、梗死周围去极化、炎症和凋亡[8]，而这几方面均与ERK1/2信号转导通路的调节有关。

ERK1/2是MAPK信号转导通路中研究最广泛的一种，普遍存在于哺乳动物的脑组织细胞中，调控多种生理病理过程，可以被多种因素广泛的激活,通过瀑布式磷酸化的三级酶联反应，将细胞外的信号传递到细胞核，从而调控细胞的增殖、分化和凋亡等生理病理过程，ERK信号转导通路在生长因子介导的细胞增殖过程中发挥重要作用已被人们所公认。

　　近年来，人们越来越关注ERK1/2转导通路在脑缺血缺氧损伤中的作用。

实验表明，脑缺血损伤或再灌注损伤后，ERK1/2的总量通常没有明显的变化，而p-ERK1/2的含量多数情况下是增加的，p-ERK1/2可被应用为衡量ERK信号通路激活的指标，然而增加的p-ERK1/2对脑组织起到的是保护作用还是损害作用，尚无定论。

目前认为，ERK1/2转导通路具有双重作用。

由外源性的生长因子、雌激素、预处理和低温等介导产生的磷酸化ERK1/2对脑组织通常倾向于起到保护作用，而损害作用主要体现在ERK1/2的活化可以促进炎症反应、氧化应激及卒中后其他促炎因子的产生。

上述研究提示此后需致力于深入探究p-ERK1/2的作用机制，尽量阻断其脑损害的作用，而发挥其保护脑组织的作用。

　　本实验通过应用15-LOX抑制剂NDGA抑制15-HETE的生成，观察缺血再灌注损伤中大鼠脑组织p-ERK1/2表达的变化，探讨p-ERK1/2在15-HETE参与的脑缺血再灌注损伤中的作用。

结果显示，与假手术组相比较，在梗死核心区及梗死周围区，脑缺血再灌注后各时间点p-ERK1/2的表达均增高，说明p-ERK1/2参与脑缺血再灌注损伤。

p-ERK1/2再灌注后1小时即开始逐渐升高，6小时达高峰，24小时有所下降，这与王强等报道的p-ERK1/2达到峰值的实验结果相一致。

应用NDGA处理后，缺血再灌注损伤的大鼠脑组织梗死体积明显减小，梗死核心区及梗死周围区p-ERK1/2的表达各时间点均下降，以6小时及24小时为著。

缺血再灌注损伤脑组织的梗死区及梗死周围区中p-ERK1/2的表达均增加，而应用脂氧化酶抑制剂NDGA后，脑组织中p-ERK1/2的表达量下降。

其可能机制是NDGA直接抑制15-LOX的表达，降低15-HETE的含量。

前期试验表明15-HETE可通过Kv通道，调节钙离子浓度等途径发挥作用，在此过程中可能是通过某种途径使p-ERK1/2的表达下降，反向证明了15-HETE在脑缺血再灌注损伤中通过ERK1/2传导通路发挥作用。

　　本实验将大鼠脑组织分为梗死核心区和梗死周围区分别取材，以便探讨再灌注损伤后脑组织不同区域的病理生理过程，并在梗死后再灌注1小时、6小时和24小时三个不同时间点观察p-ERK1/2的表达。

在梗死核心区及梗死周围区p-ERK1/2的表达均在1小时即开始升高，6小时达高峰，表明脑组织损伤的早期即有p-ERK1/2的参与。

与梗死核心区相比较，梗死周围区24小时仍可检测到较高含量的p-ERK1/2，但梗死核心区表达相对较少。

在梗死核心区，几乎所有神经细胞迅速坏死，此区神经细胞的死亡途径可能主要是坏死，24小时p-ERK1/2的表达已较少。

而在梗死周围区，24小时仍有较高p-ERK1/2的表达，此区域存在一定的侧支循环，细胞死亡途径主要是程序性细胞死亡即凋亡,细胞凋亡多位于缺血半暗区即梗死周围区，是一种迟发性神经元死亡，体内外实验亦证实了脑缺血再灌注所引发的神经元死亡主要是通过细胞凋亡而完成的。

大量实验数据已表明因ERK1/2可接受上游的级联反应信号，可以磷酸化核内的某些转录因子，将细胞表面的信号转位进入细胞核，介导了细胞表面与细胞核之间的信息传递，从而参与了细胞的增殖和分化的调控，对细胞的生存、凋亡具有调节作用。

Narasimhan等证实ERK1/2在脑内皮细胞缺血损伤中参与细胞凋亡过程。

本实验结果表明ERK1/2转导通路可能参与了15-HETE介导的脑缺血再灌注损伤中细胞的凋亡过程。

由于15-LOX抑制剂NDGA阻断了ERK1/2通路，使p-ERK1/2表达下降后，脑梗死体积减小，部分神经细胞功能可能得以恢复，表明ERK1/2通路参与了内源性15-HETE介导脑缺血再灌注损伤，但ERK1/2发挥的是促进还是抑制凋亡的作用，仍需进一步研究。

　　本实验旨在探讨15-HETE参与的脑缺血再灌注损伤中，p-ERK1/2表达的变化及其作用。

实验结果提示信号转导通路ERK1/2可能参与细胞的凋亡过程，但ERK1/2是通过下游的何种转录因子，何种途径参与的细胞凋亡过程，需进一步深入探讨。

目前脑缺血再灌注损伤是研究关注的热点，但对于其发病机制仍有很多未知领域。

降低再灌注损伤，有助于神经功能的恢复，提高患者的生活质量，因此，深入研究脑缺血再灌注损伤的发病机制有助于脑组织的保护和行之有效的治疗，具有较为实际的意义。

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