超现代实验技术离心技术.docx
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超现代实验技术离心技术
超速离心技术
超速离心技术
超速离心技术是利用物质的沉降系数、浮力、质量等方面的差异，利用强大的离心力场，使样品中的混合物得以分离、浓缩、纯化和鉴定的技术。
离心技术现在已经成为分子生物学和生物化学研究中不可缺少的一项重要技术。
离心技术可分为制备型和分析型两类。
在生物学领域可以利用这种方法，分离提取各种细胞及其亚细胞物质,如细胞膜、细胞核、染色体、线粒体、叶绿体、溶酶体、核蛋白体等。
也可以鉴定蛋白质、酶及核酸的纯度。
处理的样品可多可少，少至0.2mL以下。
离心技术的范围相当广泛.目前，利用这种技术分离各种亚细胞物质、酶、病毒、质粒及各种核酸.因此，为分子生物学、生物化学和医学的发展，提供了有利的手段。
自从1926年瑞典物理学家Svedberg制成世界上第一台超速离心机（45000转/分）到现在已有快80年的历史，在这期间,离心机的发展是非常迅速的.特别是在50年代以后发展的更快，例如，美国贝克曼（Beckman）公司和杜邦苏凡尔（DupontSorvall）公司，英国测量科学设备公司（MSE），日本的日立（HITACHI）公司以及德国的海吕斯（Heraeus）公司,都生产出各种离心机产品,如普通离心机、高速离心机和超速离心机.从简单的低速高容量的制备离心机到用于精密分析的超速离心机，应有尽有。
美国贝克（Beckman）公司的超速离心机居世界领先地位，采用了大规模集成电路，计算机程序控制,分离-检测,全部实现自动化;最高转速可达13多万转/分钟，并配有各种型号的垂直转头、水平转头、固定角转头、区带转头、连续转头等，供用户选用，不但操作简单、节省时间，而且进一步提高了的分离效率。
此外，离心技术也有了很大的发展，有密度梯度离心技术和区带离心技术，为生物大分子的分离、纯化和鉴定提供了优越的手段。
虽然离心机的种类有多种，离心技术也多种多样，但是它们的工作原理基本相似。
在实际工作中用的最多的还是制备型离心。
本课程主要介绍制备型分离技术。
一、离心原理
离心技术是根据物质在离心力场中不同的行为来分离物质的。
任何物体，当它做圆周运动时，都要经受一个向外的离心力（F）。
离心力的大小，取决于离心转头的角速度（ω，单位弧度/秒），和物质颗粒距离心轴的距离（r，单位厘米）.因此，离心力与角速度和距离的关系用方程式F=ω2r表示.
（一）离心力
离心力（F）常用地心引力来表示。
这时它指的是相对离心力（relativecentrifugalforce,RCF）。
RCF又常以重力常数（g,980厘米/秒2）的倍数来表示，所以：
为了使用方便，须用离心机的转数（即转数/分，以rpm表示，即revolutionsperminute）来表达这个系数，可将弧度变成转速：
因此
从上式可知，只要知道离心机的rpm有离心管中某物质颗粒到离心转轴的中心垂直距离r，就能够计算这个颗粒所受的离心力。
例如，一个离心转头，最大半径为9cm,转速为18000转/分，求离心转头最大离心力和最大相对离心力.
r=9cm
ω=2π18000rpm=2⨯3.1416⨯18000转/60秒=185秒-1
最大离心力=ω2r=（1885秒—1）2⨯9厘米=31979025厘米/秒2
即相当于重力的32632倍，在这种条件下离心，样品沉降速度比重力场要大32632倍。
通常,超速离心时,用g来表示，在低速离心时,则用rpm表示.
为了知道转速（rpm）、旋转半径（r）离心管液柱中间到旋转轴中心的距离和离心力（单位为g）的关系，根据上面的方程式，Dole和Cotzias制作了与转头速度和半径相对应的RCF的列线图（表1-1）。
（二）沉降系数
在离心力场作用下，物质颗粒以一定的速度向离心管底部移动，这个移动的速度可用下公式表示：
v为沉降速度。
沉降速度与离心力场成正比，这一比例常数就是沉降系数.用S表示.
所谓沉降系数，就是在单位离心力场中颗粒沉降的速度.S的单位是秒，因为许多生物大分子的S值很小，所以定义10-13秒为一个沉降系数的单位。
为了纪念超离心分析的创始入Svedberg，就把10—13秒这个数量级定为一个Svedberg单位，用S表示.
为了使沉降系数只表示样品本身的物理量，所以又规定了在20︒C的纯水中所测得样品的沉降系数，并用S20,ω表示，右下角的20表示温度，ω表示纯水。
由于许多生物大分子的沉降系数表现了浓度的依赖性,所以用浓度接近零的外推值来表示生物大分子的沉降系数，即S020,ω，右上角的零表示浓度为零。
例如，溶菌酶的沉降系数为2。
15⨯10—13秒,通常就叫做2。
15S.过氧化氢酶的沉降系数为11.35⨯10—13秒,就称11。
35S.大肠杆菌核蛋白体是70S，它是由两个亚基组成的，用超速离心方法测其沉降系数，分别为30S和50S。
当我们还不知道它们的结构时，也只好暂时以30S和50S命名,来区别它们。
蛋白质的沉降系数，一般在1~200之间。
表1—1计算离心力的列线图
为了从半径和转头速度来计算相对离心力,先以外侧标尺上的半径和转头速度的值连成直线.这一直线与中间标尺上的交点数值，就是相对离心力。
我们知道，沉降系数，是一个特定的物理量。
因此,S020,ω是一个常数（constant）。
从沉降系数的定义可以看出，它只在标准化条件下才是一个常数.但实际情况往往变化很大。
因此在实际应用中，常把标准条件下的沉降系数（S020，ω）换算成实际条件下沉降系数,才能正确运用.因为实际测量时，所用的条件大不相同,所以常常将在某种条件下测定的沉降系数加以修正。
利用这个公式进行运算以后，可以把任何条件下所测定的S值，变成以20︒C的水的密度和粘度为介质时，得到的S值。
S020,ω为以水为介质时，20︒C所测得的沉降系数.
St,m为在t温度下，以m为介质时，所得的沉降系数。
η20,ω为20︒C水的粘度.
ηt，m为介质在离心温度下的粘度。
ρp为颗粒的密度.
ρt,m为介质的密度.
ρ20，ω为20︒C水的密度。
沉降系数可用下更公式求得：
式中ω是角速度。
t为时间（秒）,变化着的时间用时间的微分dt表示。
r是颗粒运动的距离，指运动颗粒到离心转轴中心的距离（厘米）。
设单位时间内某颗粒自r1运动到r2,则上式得积分得
若用rpm计算，则ω=（rpm）⨯2π/60，再将自然对数改为常用对数，则上式可写为:
式中2.303/60ω2与rpm的换算可从表2-1中查出，式中的dlogr/dt可用logr对t作图求得。
表2—1ω2与2.303/60ω2换算关系
转速（rpm）
ω2
2.303/60ω2
转速（rpm）
ω2
2.303/60ω2
1697
4。
241⨯104
9。
050⨯10-7
12590
1。
738⨯106
2.208⨯10-8
2097
4.811⨯104
7。
978⨯10—7
13410
1。
971⨯106
1。
947⨯10-8
2233
5.466⨯104
7.022⨯10—7
14290
2.238⨯106
1。
705⨯10-8
2378
6.119⨯104
6。
192⨯10-7
15220
2。
539⨯106
1.512⨯10—8
2531
7.022⨯104
5.466⨯10—7
16200
2。
877⨯106
1.334⨯10—8
5695
7.962⨯104
4。
821⨯10—7
17250
3.262⨯106
1.177⨯10—8
2806
8。
649⨯104
4。
438⨯10—7
17980
3。
544⨯106
1。
083⨯10—8
2994
9。
826⨯104
3.906⨯10—7
19160
4.024⨯106
9。
539⨯10—9
3189
1.115⨯105
3.442⨯10—7
20410
4.566⨯106
8.406⨯10—9
3397
1。
265⨯105
3。
034⨯10-7
21740
5.181⨯106
7。
408⨯10-9
3617
1.434⨯105
2.677⨯10-7
23150
5.875⨯106
6。
533⨯10—9
3848
1。
623⨯105
2.365⨯10-7
24640
6.650⨯106
5.772⨯10—9
4059
1.806⨯105
2。
125⨯10—7
25980
7。
399⨯106
5。
188⨯10-9
4327
2。
052⨯105
1。
871⨯10—7
27690
8.405⨯106
4。
567⨯10-9
4609
2.329⨯105
1.648⨯10-7
29500
9。
540⨯106
4.023⨯10-9
4908
2。
641⨯105
1。
453⨯10—7
31410
1.082⨯107
3。
547⨯10-9
5227
2。
995⨯105
1。
282⨯10—7
33450
1。
227⨯107
3。
128⨯10-9
5563
3。
392⨯105
1.132⨯10-7
35600
1.389⨯107
2。
763⨯10—9
5784
3。
662⨯105
1。
048⨯10—7
37020
1。
502⨯107
2。
555⨯10-9
6166
4.168⨯105
9。
209⨯10-8
39460
1.707⨯107
2。
249⨯10-9
6569
4。
730⨯105
8。
115⨯10—8
42040
1。
937⨯107
1.982⨯10—9
6995
5。
364⨯105
7.156⨯10—8
44770
2.197⨯107
1.747⨯10-9
7447
3.079⨯105
6。
314⨯10—8
47660
2。
490⨯107
1。
541⨯10—9
7928
6.890⨯105
5。
571⨯10—8
50740
2。
822⨯107
1.360⨯10-9
8225
7。
416⨯105
5.176⨯10-8
52640
3.038⨯107
1。
263⨯10—9
8766
8。
424⨯105
4.556⨯10-8
56100
3.450⨯107
1。
113⨯10-9
9341
9。
565⨯105
4.013⨯10-8
59780
3。
918⨯107
9.797⨯10—10
9945
1。
084⨯105
3.541⨯10-8
63650
4.440⨯107
8.643⨯10—10
10589
1。
229⨯106
3.123⨯10—8
67770
5.035⨯107
7。
623⨯10—10
11272
1.393⨯106
2。
755⨯10—8
72140
5。
705⨯107
6。
728⨯10-10
表2—2某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的一般范围
样品
沉降系数（S）
RCF（g）
转速（rpm）
细胞
>107
<200
<1500
细胞核
4⨯104—107
600-800
3000
线粒体
2—7⨯104
7000
7000
微粒体
50—104
10万
30000
DNA
10-120
10万
30000
RNA
4—50
40万
60000
蛋白质
2-25
>40万
>60000
有了沉降系数，可以计算分子量。
因为沉降系数与物质的分子量有如下的关系：
式中：
M为物质的分子量。
D20,ω是物质颗粒在20︒C水中的扩散系数.
T是对绝对温度。
R是气体常数，等于1.987卡/度⋅克分子。
S20，ω是沉降系数。
ρ是溶剂的密度。
ν—是偏微比容，等于物质颗粒密度的倒数。
用这个公式计算分子量的方法，俗称SD法。
表2-3几种蛋白质的沉降系数和分子量
样品
分子量
沉降系数
核糖核酸酶
13683
1.64
卵清蛋白
45000
3。
55
血清白蛋白
65000
4。
31
血红蛋白
68000
4。
54
过氧化氢酶
250000
11.30
尿素酶
480000
18.60
二、离心方法
超离心技术分离生物大分子和亚细胞物质有两种方法，即沉降速度法和沉降平衡法.
在离心过程中，颗粒在均匀的介质中移动，常受到振动、温差和对流的干扰。
因此，要利用密度梯度来消除和减轻这种现象。
许多物质可以形成密度梯度,如蔗糖、甘油、NaI、CsCl、Cs2SO4等,都可以形成一个从离心管顶端到底部逐步增加的平滑的密度梯度。
沉降速度法，主要是根据各种被分离物质的沉降系数的不同来分离物质。
注意，梯度中最大的密度要小于样品中最小颗粒的密度。
沉降平衡法，主要是根据被分离物质的密度不同来分离物质.注意,梯度中最大的密度要大于样品中最大颗粒的密度。
在沉降速度法中，有差速离心法和区带离心法。
（一）差速离心法
这种方法是逐步增加离心力的方法。
先选择适当的离心力，使大颗粒物质沉淀,从而得到一个上清液，一个沉淀.然后进行分离,弃去沉淀，增加离心力，进一步离心上清液,使中等颗粒沉淀，最后使小颗粒物质沉淀。
差速离心法，常用于从组织匀浆中分离细胞器。
例如：
在0.25M蔗糖中的10％（w/v）的肝匀浆
↓1000g，离心10分钟
粗制细胞核沉淀←—--——--—-——-—-——→上清液
↓3300g，离心10分钟
粗制线粒体沉淀←-————-——--—-—-—-→上清液
↓16300g，离心20分钟
粗制溶酶体沉淀←-—---——-———-——--→上清液
↓100000g，离心60分钟
粗制微粒体沉淀←—---—---——-—--——→上清液
图3-1大白鼠肝脏匀浆分级分离成各种亚细胞组分的示意图解
这种离心的方法，每次离心只能分离出一种物质，而且得率和纯度都受到一定的限制。
（二）区带离心法
又叫速度一区带离心法或沉降系数一区带离心法。
它是将样品放在一个连续的密度梯度液体上。
这个密度梯度的最大值应该小于样品中的最小密度值。
这个密度梯度只是为了防止形成的区带由于对流而引起的混乱，然后进行离心。
直到各种颗粒.在密度梯度中形成不连续的区带。
但是要注意,在重的组分到达管底之前，必须停止离心.
这种方法已用于分离RNA、DNA的混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分，它适用于分离密度相同而大小不同的物质。
一般来说，蛋白质的密度相同，但分子量有差别，用这种方法很容易将它们分开.但是不能很好地分离一些密度不同而大小类似的物质。
如线粒体，溶酶体，过氧化氯酶系等。
因此，必须采用沉降平衡法。
区带离心法对于凡是沉降系数相差20％的组分可以有效的分离.一次可以分离几个样品，而且回收率和纯度都能达到百分之百。
但是每次处理的样品量不能太大。
（三）沉淀平衡法
这种方法主要是从密度梯度离心技术发展起来的一种方法.又叫等密度离心法（Isopycnicgradientcentrifugation）。
它是入为的在离心管中造成一个连续的密度梯度。
而且密度梯度柱的梯度很大，使底部的溶液密度明显的大于样品组分的密度。
也就是说，这个密度梯度包括了所要研究的所有颗粒密度范围.将样品放在顶部或将样品均匀的分散在密度梯度柱中,然后进行离心。
样品在离心管中运动，样品中密度大于周围溶液密度的组分向下沉降,而样品中密度小于溶液密度的组分将向上浮起。
这两种运动一直延续到所有组分都到达某一平衡位置，在这个位置上组分的密度正好等于周围的溶液密度，组分形成一平衡区带,即使再离心，区带的位置也不会再有变化了。
各个组分区带停留在与自己相同的密度中，所以也叫做等密度梯度离心。
它们所用的密度范围较大.梯度密度的最大值，必须比密度最大的样品还要大。
为了使样品所有组分都能达到它们的平衡密度，需要长时间高速离心.这种方法适用于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
因为大多数蛋白质几乎具有相同的密度。
所以，分离蛋白质不采用此法，而分离核酸常采用此法。
在1958年,利用等密度梯度离心技术，直接的证明了DNA双螺旋结构的自我复制。
密度梯度离心技术已广泛地应用于细胞、细胞器、病毒、核酸、蛋白质的物理化学性质的研究。
是这些生物材料分离纯化不可缺少的方法之一.
等密度梯度离心法，只要密度相差0。
05即可用此方提纯。
如果用分析超离心检测，可以分辨密度差为0.001的组分，而且一次分离.但平衡离心时间很长,一般在十几到几十小时.
总之,沉降速度法是一种动力学的方法。
关键是选择适合的离心力；而沉降平衡法是静力学的方法，重要的是选择适合的密度梯度溶液。
（四）密度梯度的制备及离心后的处理
在离心技术中，密度梯度有两种，连续的密度梯度和不连续的密度梯度或者叫做分层的密度梯度,是将密度不同的溶液一层一层的放在离心管中.如下图所示，密度最大的放在最下层,密度小的放在上边，要分离的样品放在最上面，然后进行离心.这个密度梯度的优点，可允许增加梯度的容量，而且可入为地将被分离物质分布得更加集中。
连续的密度梯度是通过一种特殊的密度梯度混合仪，来制备不同的密度梯度，然后将样品放在上面进行离心。
表3-1中给出了一些蔗糖溶液的特性.
表3—1蔗糖水溶液的密度及粘度
密度
浓度
粘度
0︒
20︒
%g/g
M
M’
0︒
5︒
20︒
1.000
1.79
1。
52
1。
005
1。
010
1.008
2。
49
0。
073
0.075
1。
90
1。
60
1。
06
1.020
1。
017
4.92
0.146
0.151
2。
04
1。
72
1。
13
1。
030
1.027
7。
32
0.220
0.231
2.21
1。
86
1。
22
1.040
1。
037
9.68
0。
293
0.313
2.41
2.02
1。
31
1.050
1。
047
12.01
0.367
0.399
2。
64
2.22
1。
43
1。
060
1。
056
14。
31
0。
441
0。
488
2.91
2。
44
1。
55
1.070
1.066
16.57
0.516
0.580
3.23
2.70
1.70
1.080
1。
076
18.80
0.591
0。
676
3.57
2.97
1.85
1。
090
1。
085
20.99
0.666
0.776
3.97
3。
29
2.03
1。
100
1.098
23.15
0。
741
0。
880
4。
45
3.67
2。
24
1.110
1。
105
25。
28
0。
816
0。
988
5。
00
4.11
2.48
1.120
1。
115
27。
37
0.891
1。
101
5.67
4。
63
2.76
1。
130
1.124
29.44
0。
967
1。
219
6。
45
5。
25
3.09
1.140
1.134
31.47
1.043
1。
342
7.38
5。
98
3.47
1.050
1.144
33.48
1.119
1.470
8.50
6.85
3。
92
1。
160
1.154
35。
45
1。
195
1。
605
9。
88
7.91
4.45
1。
170
1。
163
37.40
1。
271
1.746
11。
6
9。
20
5。
09
1.080
1.173
39.33
1。
348
1。
894
13.7
10。
8
5.86
1.190
1。
183
41.23
1.425
2.050
16.4
12。
8
6。
80
1。
200
1。
193
43。
11
1。
502
2。
214
19.8
15.3
7.94
1。
210
1。
202
44.97
1.580
2.387
24.2
18。
5
9。
36
1.220
1。
212
46.80
1.657
2.570
29.9
22。
6
11。
1
1。
230
1.222
48.61
1.735
2.763
37.3
27。
9
13.3
1.240
1。
232
50.40
1。
814
2.969
47。
2
34。
9
16.1
1.250
1.242
52。
17
1.892
3。
187
60.6
44.2
19。
7
1.260
1。
251
53。
92
1。
971
3.419
78。
9
56。
8
24.4
1。
270
1。
261
55.65
2。
051
3.666
105
74。
0
30.6
1。
280
1.271
57.37
2.130
3。
931
141
98.3
39。
0
1.290
1.281
59。
06
2。
210
4。
214
195
133
50.3
1。
300
1.291
60。
74
2。
290
4.519
275
184
66.1
1。
310
1。
301
62.39
2。
371
4.847
400
261
88.5
1。
320
1.310
64。
04
2。
452
5。
202
597
380
121
1。
330
1。
320
65.66
2。
533
5。
586
8918
570
169
1.340
1。
330
67。
27
2。
614
6.004
1470
880
242
1。
350
1.340
68。
86
2.696
6.416
2440
1410
357
浓度以每100克溶液中克数、体积克分子浓度M及重量克分子浓度M’表示，粘度以对纯溶剂的ηrel表示。
密度梯度混合仪有两种装置：
简易装置和自动装置。
1.简易梯度混合仪（图5—4）：
它由二个具有相同半径的有机玻璃圆柱形成的小室组成，底部通过一个带有控制活塞的管子，使内部连接起来,这个活塞能调节两个圆柱小室中的溶液混合.一个装密度大的溶液，一个装密度小的溶液。
装密度大的溶液的小室内有搅拌器,并有一个通向离心管的出口。
开始时，两个小室中的溶液高度被调到静压力相等。
然后开动搅拌器,同时打开控制活塞,并使密度大的溶液流入离心管.流入离心管的出口，要紧贴离心管管壁,随着液体的注入，将小管流出口向上慢慢移动,直至最后。
注意，混合时注入离心管的流速要慢，一般装入一支5mL出5~10%蔗糖梯度的离心管，应在10~15分钟内完成。
2.自动梯度混合器：
DGF—U型密梯度混合器.此装置可同时制成1~6支梯度管，又能在离心后自动分层分部地把各物质取出。
整机剖面图如图所示。
它是由蠕动泵、分配器、升降器、液面探测针等部件组成。
整个装置由控制板上的选择器旋钮来控制仪器的运转和导管的升降，由蠕动泵控制流速在0～5mL/分之间.操作时，先将配制好的轻、重溶液分别装于两个直径相同的30～100mL的小烧杯中。
如果同时制备6支梯度离心管，每支要求有5mL梯度液,则总量应是30mL。
此时应将l5mL轻溶液和
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