实验一糖和蛋白质的理化性质检验.docx

实验一糖和蛋白质的理化性质检验.docx

《实验一糖和蛋白质的理化性质检验.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验一糖和蛋白质的理化性质检验.docx（10页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

实验一糖和蛋白质的理化性质检验

实验一糖和蛋白质的理化性质检验

（4学时）

第一部分蛋白质的理化性质

第一节蛋白质的颜色反应

一、实验目的

掌握鉴定蛋白质的原理和方法。

二、实验原理

蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。

颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。

颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.鸡蛋1个

2.吸管（×1）

3.试管１.5cm×15cm（×2）

4.试管架

5.试管夹2个

6.PH试纸（5-7）

7.水浴锅

实验试剂

1.卵清蛋白液：

将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。

2.1%茚三酮溶液：

1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。

3.浓硝酸：

比重。

4.10%NaOH溶液：

10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。

四、实验方法

A.黄色反应

蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。

遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。

反应如下：

操作方法：

于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10％NaOH溶液20滴，观察颜色变化。

B.茚三酮反应

蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。

此反应为一切蛋白质及ａ-氨基酸所共有。

含有氨基的其他物质亦呈此反应。

亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。

操作方法：

取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。

注意：

此反应必须在pH5－7进行。

C.双缩脲反应（参考实验）

将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。

双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解，及用比色法作蛋自质之定量测定）。

其反应式如下：

操作方法：

1.取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸试之。

至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。

然后加10％NaOH溶液1mL摇匀，再加2滴1％硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。

2.另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10％NaOH溶液10滴及１％硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。

注意：

硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu（OH）2。

此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu（NH3）42＋，妨碍此颜色反应的观察。

第二节蛋白质的沉淀反应

一、实验目的

1.熟悉蛋白质的沉淀反应。

2.进一步掌握蛋白质的有关性质。

二、实验原理

多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。

蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。

可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。

不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.试管×15cm（×5）。

2.吸管ｍL（×2），ｍL（×3），ｍL（×1）。

3.玻璃漏斗Φ5cm1个。

4.滤纸Φ9cm1张。

实验试剂

1.蛋白质试液：

见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。

2.硫酸铵晶体：

如颗粒太大，最好研碎。

3.饱和硫酸铵溶液：

蒸馏水100ｍL加硫酸铵至饱和（硫酸的饱和度：

707g/1000mL）。

4.95％乙醇。

5.结晶氯化钠。

6.1%醋酸溶液：

冰醋酸1ｍL用蒸馏水稀释至100ｍL。

7.5％鞣酸溶液：

5g鞣酸溶于水并稀释至100ｍL。

四、实验方法

A.蛋白质盐析作用

向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。

操作方法：

1.取蛋白质溶液4mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50％饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。

分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。

2.将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵粉末（约），至不再溶解，析出的即为清蛋白。

再加水稀释，观察沉淀是否溶解。

注意：

（1）应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；

（2）固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。

B.乙醇沉淀蛋白质

乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。

操作方法：

取蛋白质溶液1ｍL，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95％乙醇3mL混匀。

观察有无沉淀析出。

C.生物碱试剂沉淀蛋白质

植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。

能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。

生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。

操作方法：

取1支试管，加入2ｍL蛋白质溶液及1％醋酸溶液4-5滴，向一管中加5％鞣酸溶液5~8滴，观察结果。

D.重金属盐沉淀蛋白质（参考实验）

蛋白质与重金属离子（如Cu2＋,Ag＋，Ｈg2＋等）结合成不溶性盐类而沉淀。

操作方法：

取试管2支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加１％醋酸铅溶液，另一管内滴加1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。

第二部分糖的理化性质

第一节糖的颜色反应

A.莫氏试验

一、实验目的

掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。

二、实验原理

糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物。

利用这一性质可以鉴定糖。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.棉花或滤纸。

2.吸管ｍL（×4）、ｍL（×1）。

3.试管×15cm（×4）。

4.水浴锅

实验试剂

1.莫氏试剂：

称取ａ-萘酚5g，溶于95％乙醇并稀释至100ｍL。

此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。

2.1%蔗糖溶液：

称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ｍL。

3.1%葡萄糖溶液：

称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ｍL。

4.1%淀粉溶液：

将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。

5.浓硫酸

四、实验方法

于4支试管中，分别加入1mL1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1mL水中），然后各加莫氏试剂２滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加人浓硫酸（切勿振摇！

），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。

注意：

1.一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。

此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。

2.亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替ａ-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。

3.莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环。

B.杜氏试验

一、实验目的

掌握杜氏（Tollen）试验鉴定戊糖的原理和方法。

二、实验原理

戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：

本试验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖特有反应。

果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应。

戊糖反应最快，通常在45s内即产生红色沉淀。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.吸管（×1）

2.试管×15cm（×3）

3.水浴锅。

实验试剂

1.杜氏试剂：

1%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100mL95％乙醇中）3mL，缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得，临用时配制。

2.1%阿拉伯糖溶液：

称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。

3.1%葡萄糖溶液：

见试验A。

4.1%半乳糖溶液：

称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。

四、实验方法

于3支试管中各加入杜氏试剂1mL，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。

各试管同时放入沸水浴中，观察颜色变化并记录颜色变化时间。

C.塞氏试验（参考实验）

一、实验目的

掌握塞氏（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。

二、实验原理

酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5一羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。

以糖为例，其反应如下。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.移液管（×3），（×1）

2.试管×15cm（×3）。

3.水浴锅。

实验试剂

1.塞氏试剂：

溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中（V（H2O）:

V（HCl）＝2:

1），临用时配制。

2.1%果糖溶液：

称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。

3.1%葡萄糖溶液：

见试验A。

4.1%蔗糖溶液：

见试验A。

四、实验方法

于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%果糖溶液各，各加塞氏试剂，摇匀，同时置沸水浴内。

比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。

注意：

①在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。

葡萄糖与麦芽糖亦呈阳性反应，但呈色反应的速度较酮糖缓慢。

果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热后20-30s内，生成的沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。

第二节糖的还原作用

一、实验目的

掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。

二、实验原理

费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu2＋的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O（由于沉淀速度不同，形成的颗粒大小不同，颗粒大的为红色，小的为黄色。

）此法常用作还原糖的定性或定量测定。

其反应表示如下：

目前临床上多用本尼迪特法，此法具有如下优点：

①试剂稳定，不需临用时配制；②不因氯仿的存在而被干扰；③肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小。

三、实验器材与试剂

实验器材

1.移液管（×3）、（×１）。

2.试管×15cm（×3）。

3.水浴锅。

4.试管架。

实验试剂

1.本尼迪特试剂：

称取85g柠檬酸钠（Na3C6H3O7·11H2O）及50g无水碳酸钠，溶解于400mL蒸馏水中。

另溶解硫酸铜于50mL热水中。

将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。

此混合液可长期使用。

2.费林试剂（参考实验）

试剂A：

称取硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水并稀释至500mL。

试剂B：

称取氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。

临用时将试剂A与试剂B等体积混合。

3.1％淀粉溶液：

将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。

4.1％蔗糖溶液：

称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。

5.1％葡萄糖溶液：

称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。

四、实验方法

取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，然后每管加本尼迪特试剂2mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。

另于3支试管中加人费林试剂A和B各１mL，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化（此为参考实验，本实验不做）。

五、实验报告

1.内容与要求：

实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、实验步骤、实验现象、结果分析与讨论。

2.思考题

（1）双缩脲、茚三酮、黄色反应适用鉴别的对象是什么？

（2）什么叫蛋白质的变性？

盐、乙醇、重金属、生物碱沉淀蛋白质反应哪些是可逆反应，哪些是不可逆反应？

（3）莫氏、塞氏、杜氏颜色反应适于鉴别哪类糖？

（4）比较斐林和本尼迪特试剂法有何异同？