液相色谱柱操作技术.docx

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液相色谱柱操作技术

液相色谱柱操作技术

杨征敏

液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。

正相柱大多以硅胶为

柱，或是在硅胶表面键合CN,

NH3

等官能团的键合相硅胶柱；反相柱

填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）

称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。

另外还有离

子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。

反相色谱柱的选择

1．柱子的PH值使用范围

反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。

但硅胶为基质

的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。

一般的C18柱PH值范围都

在28，

流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时

硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。

一旦发生上述情况，色谱柱入

口处会塌陷。

同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。

如果流动相PH较

高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子。

2．戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱

戴安公司有28种柱子，Acclaim反相柱填料高纯，金属含量极低，完全

封尾。

PH29

范围内兼容，低流失，高柱效。

尤其是推出的Acclaim极性封

尾C16柱，是最先商品化的磺酰氨O

链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活

性，能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。

对酸性和碱性化合物有

极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有更好的立体选择性。

液相色谱柱的使用

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今

后评价柱性能变化的参考。

在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条

件进行（出厂测试所使用的条件是最佳条件），只有这样，测得的结果才有可

比性。

但要注意：

柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差

异而有所不同。

1、样品的前处理

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质（固体不溶物、无机盐和细菌）。

2、流动相的配制

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，

因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长

时间保留在柱中）。

b、流动相与样品不产生化学反应

c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的

使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。

如使用UV检测器，最好使

用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。

除去溶解在流动相中的微量气体既

有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱

效。

对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。

对于内

径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳；对内径为4.6mm的分析柱，流速

一般选择1.0ml／min；对内径为10mm的制备柱，流速常选3.0ml／min为

佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。

可采用改变流动相的洗涤强度

的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。

注意：

a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不

要过夜。

最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

b．流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用

寿命，提高柱性能。

色谱柱的维护

1.色谱柱的平衡

反相色谱柱是保存在乙腈中的。

新柱应先使用10－20倍柱体积的甲

醇或乙腈冲洗色谱柱。

请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互

溶。

每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获

得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！

操作步骤：

a.平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线

（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）

b.如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前

必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必

须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护

柱子。

2．色谱柱的再生

长期使用的色谱柱，柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。

可以对色

谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。

建议用来冲洗柱子的溶剂体积

色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积

1254mm

1.6ml30ml

2504

mm3.2ml60ml

25010mm

20ml400ml

选择再生方法：

极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：

正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

非极性固定相（如反相色谱填料RP18，

RP8，

CN等）的再生：

水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水

注意：

A、在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的

形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲

洗至碱溶液完全流出。

B、0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶

剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用

0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

3.色谱柱的维护

A、使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定

的溶解度）。

B、大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱

的pH范围。

C、避免流动相组成及极性的剧烈变化。

D、流动相使用前必须经脱气和过滤处理。

E、如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲

洗干净，并保存于甲醇或乙腈中

F、氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接

管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

HPLC的正确使用和科学保养

1、保持贮液瓶清洁，对专用贮液瓶应定期清洗；用试剂瓶作贮液瓶时，要

经常更换。

2、定期（如半个月）在4~6M稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过

滤器畅通无阻。

3、使用HPLC试剂和新蒸二次蒸馏水作流动相，所使用的溶剂其截止波长

一定要低于检测波长，对不是HPLC级的试剂要进行过滤（HPLC试剂

出厂前已用0.02μm滤膜过滤）。

对流动相一定要脱气。

4、每天开始使用仪器，注意放空排气，确保泵头、流动池以及其它流路系

统中无气泡存在。

5、珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。

如避免

泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。

6、采用保护（警戒）柱，延长柱寿命。

如污染物堆积于保护柱柱头，造成

柱压升高，柱效下降，峰形变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新

保护柱。

7、避免超负荷进样，对250×4.6mm的柱子,绝对进样量应不超过100μg。

在灵敏度允许的前提下，应尽量将试样浓度降低，减少绝对进样量（进

样体积可保持不变），这是保持HPLC柱性能持久良好的重要举措之一。

8、经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。

反相柱用异丙

醇—二氯甲烷（1/1）冲洗，正相（硅胶柱）用纯甲醇或异丙醇冲洗，时

间均不少于1h。

9、做完试验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对过夜的柱子和

进样阀，一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液，再用甲醇或

乙腈冲洗，并保存在乙腈中。

正相柱保存在非极性有机溶剂中。

10、以硅胶为基质的柱子，如C18

、C8

等，要控制好流动相的pH值，一

般不要低于2.5，不高于7.0。

11、尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在

系统中由于溶解度降低而析出。

12、对于阻塞或受伤严重的柱子，必要时，可卸下不锈钢滤板，超声洗去滤

板阻塞物，对塌陷污染的柱床进行清除、填充、修补工作，此举可使柱

效恢复到一定程度（80%），有继续使用的价值。

13、色谱仪检测器输出与积分仪（处要匹配，要合理设置参数如斜率、半峰

宽、阈值、AUFS值、衰减等。

将适宜的进样量和合适的参数结合起来，

使主峰峰高达到记录仪满量程的80%左右。

14、用HPLC分析酸碱性物质，由于吸附作用（次级保留）使峰开拖尾。

加

入改良剂可以大大改善峰形，提高积分的准确度。

一般规则是：

（1）分

析酸性物质，可加入1%有醋酸。

（2）分析碱性物质，可加入1020mmol/

L

三乙胺。

（3）酸碱物质混为一体，可同时加入1%的醋酸和1020mmol/

L

三乙胺。

气相色谱仪工作原理及组成部分

气相色谱工作原理：

是利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数

不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行

反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，因此各组份在色

谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱

进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

气相色谱仪的组成：

（1）载气系统：

包括气源、气体净化、气体流速控制和测量

（2）进样系统：

包括进样器、汽化室（将液体样品瞬间汽化为蒸气）

（3）色谱柱和柱温：

包括恒温控制装置（将多组分样品分离为单个）

（4）检测系统：

包括检测器，控温装置

（5）记录系统：

包括放大器、记录仪、或数据处理装置、工作站

HPLC的故障及处理

（一）保留时间变化

1.柱温变化柱恒温

2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液

4.柱污染每天冲洗柱

5.柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相

6.柱快达到寿命采用保护柱

（二）保留时间缩短

1.流速增加检查泵,重新设定流速

2.样品超载降低样品量

3.键合相流失流动相PH值保持在3~7.5，检查柱的方向

4.流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加柱恒温

（三）保留时间延长

1.流速下降管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱

3.键合相流失同前

（二）3

4.流动相组成变化同前

（二）4

5.温度降低同前

（二）5

（四）出现肩峰或分叉

1.样品体积过大

用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强

采用较弱的样品溶剂

3.柱塌陷或形成短路通道

更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件

4.柱内烧结不锈钢失效

更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品

5.进样器损坏

更换进样器转子

（五）鬼峰

1.进样阀残余峰

每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗

2.样品中未知物

处理样品

3.柱未平衡

重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱）

4.三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱）

每天新配,用抗氧化剂

5.水污染（反相）

通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水

（六）基线噪声

1.气泡（尖锐峰）

流动相脱气,加柱后背压

2.污染（随机噪声）

清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂

3.检测器灯连续噪声

更换氘灯

4.电干扰（偶然噪声）

采用稳压电源,检查干扰的来源（如水浴等）

5.检测器中有气泡

流动相脱气,加柱后背压

（七）峰拖尾

1.柱超载

降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

2.峰干扰

清洁样品,调整流动相

3.硅羟基作用

加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品

4.同前（四）4

同前（四）4

5.同前（四）3

5.同前（四）3

6.死体积或柱外体积过大

连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管

7.柱效下降

用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱

（八）峰展宽

1.进样体积过大同（四）1

2.在进样阀中造成峰扩展进样前后排出气泡以降低扩散

3.数据系统采样速率太慢设定速率应是每峰大于10点

4.检测器时间常数过大设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高增加柱温,采用低粘度流动相

6.检测池体积过大用小体积池,卸下热交换器

7.保留时间过长等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱

8.柱外体积过大将连接管径和连接管长度降至最小

9.样品过载进小浓度小体积样品

10.管路阻塞：

系统中管路阻塞的现象很少见，常见的是烧结过滤片（玻璃

砂芯）阻塞。

用烧结过滤器或过滤片（孔径210um）

能去掉阻塞管路的

微粒（如0.25mm管径）。

阻塞是管路的主要故障。

管路完全或部分阻塞是由下列原因引起的：

①没有很好过滤流动相；

②样品中有微粒；

③泵或进样器垫圈产生碎片；

④预柱、护柱和分析柱中漏出填料；

⑤毛刺和锉屑进入；

⑥流动相中的结晶盐；

⑦微生物；

⑧系统中进入了其它颗粒性物质。

症状：

管路完全阻塞，压力会突然升高，超压。

部分阻塞开始不明显，

不断滞留在液流中的微粒压力会慢慢升高，最后完全阻塞。

管路阻塞同时

会看到接头或垫圈渗漏，低压好一些，高压渗漏明显。

用系统分段法检查阻塞的管路：

从后向前分别松开接头检查，找

到阻塞管路后，应立即拆下来疏导或换新。

如果是非刚性物质阻塞，如生

物样品中的生化物质（蛋白质）、微生物等，可用极细的金属丝导通，也可

以在火头上烧一烧，使有机物炭化，而后再导通。

如果是刚性物质阻塞，

则导通十分困难，采用反冲的办法有时能成功。

就是将管子调头用泵冲洗。

操作时要注意保护眼睛和裸露的皮肤，因阻塞物会以很高的速度冲出来。

无法导通的管路要换上同样规格的管子。

如果换上新管后又被阻塞，则应

该停机检查上面提到的引起阻塞的几种原因。

输液泵的维护和使用注意事项

一、为了延长泵的寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：

1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、

密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。

流

动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，可采用Millipore

滤膜（0.2um或0.45um）等滤器。

泵的入口都应该连接砂滤棒（或片），

输液泵的滤器应经常更换。

2、流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵

内，尤其是停泵过夜或更长时间的情况下。

如果将含有缓冲液的流动相

留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静止，就可能析出盐

的微小晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。

因

此，必须泵入纯水充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维

护的溶剂（对于反相键合固定相，可以是甲醇或甲醇和水）。

3、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转也磨损柱

塞、密封环或缸体，最终产生漏液。

4、输液泵的工作压力不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变

形，产生漏液。

5、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果

有大喊大量气泡，泵就无法工作。

二、如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应的措施排除故障：

1、没有流动相流出，又无压力指示。

原因可能是泵内有大量的气体，这

时可打开泄压阀，使泵在较大的流量（5ml/min）下运转，将气泡排尽，

也可用一个50ml的注射器在泵出口处帮助抽出气体。

另一个原因可能

是密封环磨损，需更换。

2、压力的流量不稳。

原因可能是气泡，需要排除，或者是单向阀内有异

物，可以卸下单向阀，浸入丙酮内，进行超声清洗。

有时有可能是砂滤

棒内有气泡或被盐的微小晶体粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，卸下

砂滤棒浸入流动相内，超声除气泡，或将砂滤棒（片）浸入稀酸（如4mol/L

硝酸）内迅速除去微生物或将盐溶解，再立即清洗。

3、压力过高的原因，是管路被堵塞，需要清除或清洗。

压力降低的原因

则可能是管路有泄漏。

检查堵塞或泄漏时可以逐段进行。

制备色谱技术与操作及实验经验

（1）分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。

制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。

为了加快分离的时间与提

高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离

负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长

度，使用的相对多的流动相。

然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，

往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。

制备色谱，要解决容量与柱

效之间的矛盾，对重现性也要考虑。

从经济上来说。

制备色谱要争取少

用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。

（2）样品的前处理：

制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，

必要的前处理就显得非常的必要。

萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单

的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以

去掉杂质。

（3）TFA（三氟乙酸）在缓冲液中的作用：

（A）TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.050.1%，

过高的浓

度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响柱子寿命。

（B）同时TFA可以抑制硅胶表面硅醇基，改善碱性化合物的峰型。

有时0.1%TFA分离不好的话。

可以考虑加大浓度到0.2%。

但要

注意用完后及时冲洗色谱柱。

（C）走梯度时，因为走成基线漂移，但对制备的影响不大。

（4）降柱低压方法：

1%乙酸水溶液和甲醇二元梯度（时间/甲醇：

0/100，30/10，

60/100）。

挖柱填柱。

（5）提高检测限的方法：

如果是等度洗脱，一定要改成单元等度（流动相混在一个瓶子里）。

尽量采用乙腈/水系统洗脱。

乙腈紫外吸收小，相同条件下，噪音小。

（6）HPLC用水的要求：

不含金属离子和细菌。

（7）HPLC分析方法开发中流动相的调整“秘诀”：

秘诀1：

由强到弱：

一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或缓冲溶液）

进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调

整有机溶剂（乙腈或甲醇）的比例。

秘诀2三倍规则：

每减少10%的有机溶剂（甲醇或乙腈）的量，保

留因子约增加3倍，此为三倍规则。

这是一个聪明而又省力的办法。

调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

秘诀3粗调转微调：

当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%

的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分

离情况不再改变。

关于HPLC的常见问题及解答

一、问:

用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原

因何在？

如何解决？

关于漂移问题：

1．温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定

2．流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3．柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡

关于快速变化问题

1．流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定

2．泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

3．流动相不合适，改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

二、问:

液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。

2．存在干扰峰，使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

三、问：

HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

1．样品量不足，解决办法为增加样品量

2．样品未从柱子中流出。

可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3．样品与检测器不匹配。

根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4．检测器衰减太多。

调整衰减即可。

5．检测器时间常数太大。

解决办法为降低时间参数

6．检测器池窗污染。

解决办法为清洗池窗。

7．检测池中有气泡。

解决办法为排气。

8．记录仪测压范围不当。

调整电压范围即可。

9．流动相流量不合适。

调整流速即可。

10．检测器与记录仪超出校正曲线。

解决办法为检查记录仪与检测器，重作

校正曲线。

四、问：

做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？

如何解决？

原因可能有：

1．泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；

2．比例阀失效，更换比例阀即可；

3．泵密封垫损坏，更换密封垫即可；

4．溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；

5．系统检漏，找出漏点，密封即可；

6．梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

五、问：

我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

答：

柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。

其原因有多方面，而且常常并

不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1．拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再

检查；

2．把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若

压力下降，再检查；

3．将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，

（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。

这时，如果柱压仍

不下降，再检查；

4．更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正

是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。

若柱压还高，请与厂商联系。

一

般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的

问题，SGE提供的Rheodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

HPLC系统的酸清洗和钝化

30％磷酸水溶液通过酸反应和强表面活性剂／洗涤剂的共同作用，可以

有效地清洁不锈钢及其它润湿的部件。

这一方法比更常用的硝酸“钝化”绝

对更有效、且较少损害（特别是对日常使用低紫外波长的应用来说）。

这一磷

酸清洗步骤不是起钝化作用，但它是系统钝化前清洗的第一步。

一般来说，

对于阳离子的离子色谱分析或配有氧化方式的电化学检测器以外的应用不

需要钝化系统。

因为有真空脱气机（每个通道体积为8m1），可不必用磷酸；

中洗全部通道。

如果你计划四个通道都要用，则可用湿灌注的方式以4mL

／min流速对每个通道清洗8～10分钟来清洗脱气机。

这一步完成后你必须

彻底淋洗管路，用水淋洗2～3次以便将磷酸从溶剂过滤头等部件冲洗净。

安装好的HPLC系统的酸清洗和钝化

HPLC系统内部可能的污染物来自人的触摸，暴露在实验室化学环境，

与零部件制造相关的残留物，或来自先前的流动相和样品的残余物。

虽然系统自身也会逐步地被流动相清洗，但某些释放出的杂质会吸附在色

谱柱上以及检测器润湿的表面上，因而会降低总的性能。

磷酸清洗：

通常用于从系统中除去有机杂质。

可能是由于洗涤作用，它似乎比强

有机溶剂更好也更快。

这一步清洗必须在硝酸钝化之前完成。

硝酸钝化：

实际上是作用于不锈钢表面，在表面上生成均匀的氧化层。

这层氧化膜

保护不锈钢免受腐蚀（卤化物，螯合剂，等等）并且尽量减少浸出的金属离子

进入流动相。

以下应用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸钝化，包括：

•所有的氨基酸分析系统

•所有包含电化学检测器的系统

•所有要分析无机阳离子，包括过渡金属的系统

•所有利用柱后添加衍生试剂或络合样品组分的系统

以下应用需要