乙肝病毒诱导IIA型磷脂酶A2表达的分子机制研究.docx

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乙肝病毒诱导IIA型磷脂酶A2表达的分子机制研究

1.1研究意义

原发性肝癌（HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高、生存期短。

我国是世界上HCC死亡率最高的国家，占世界上肝癌总死亡人数的53%。

全球每年新患肝癌患者中约55％发生在我国，约有30多万人被诊断为HCC，且肝癌发病率和死亡率有逐年升高的趋势，因此，我国的肝癌诊治形势十分严峻 [1-3]。

目前乙肝病毒（HBV）是公认的HCC主要诱因之一，HBV感染机体后能够引发慢性乙型肝炎（CHB），最终发展成为肝纤维化（LC）和HCC。

HBV编码的病毒蛋白在诱发肝癌形成过程中发挥了至关重要的作用，然而其分子机制不明。

HBV编码病毒蛋白如何调控宿主基因的表达并在HBV致HCC中发挥的作用是目前研究的核心问题[4,5]。

因此，揭示在HBV致HCC中发挥关键作用的因子，并探讨HBV病毒蛋白调控其表达的分子机制，将可能为HBV相关HCC治疗提供有效的干预靶点。

在前期研究中，我们采用基因芯片筛选了整合HBV全基因组的HepG2.2.15细胞及其对照细胞HepG2的差异表达基因，发现IIA型磷脂酶A2（PLA2G2A）的表达水平在HepG2.2.15细胞显著升高，并且采用RT-PCR和 westernblot对芯片结果进行了验证，血清学检测结果显示慢性乙肝患者PLA2G2A血清学水平较健康对照高。

同时, 证实了PLA2G2A能够促进HBV的复制（见工作基础）。

由于PLA2G2A在肿瘤多种恶性生物学表型调控（增殖、恶性转化、血管生成、侵袭等）中发挥重要作用[6]，我们进一步采用基因芯片筛选了HBV相关肝癌组织及癌旁组织中差异表达基因，发现PLA2G2A 的表达在癌组织显著上调；临床标本检测结果显示HBV相关肝癌组织中 PLA2G2A表达较相应癌旁组织高。

然而，HBV是通过哪个病毒蛋白调控PLA2G2A的表达？

其调节的信号通路如何？

PLA2G2A又如何参与HBV相关肝癌的发生和发展？

目前国内外还没有相关报道。

本研究将阐明HBV病毒蛋白在转录水平调控PLA2G2A表达的分子机制及PLA2G2A对HBV致HCC形成及其恶性表型的影响。

研究结果不仅有助于完善HBV调控宿主信号网络分子机理，同时为肝癌的临床诊断、潜在的分子靶向治疗及预后判断提供新的思路。

1.2国内外研究现状及发展动态分析

1.2.1HBV是导致HCC形成的最主要因素

全球超过20亿人感染HBV，每年估计有32万人死于HBV相关疾病，大约有30-50%的HBV死于HCC[7,8]。

临床研究表明：

慢性HBV感染者的HCC发病危险性要比无HBV感染的普通人群高出200倍[9]。

我国肝癌病例80%以上是慢性乙肝患者。

由此可见：

HBV感染是引起HCC肝癌高发病率的主要危险因素。

HBV病毒感染导致HCC的发生是一个多因素、多阶段的复杂过程，主要包括宿主和病毒两方面的因素。

如下图所示。

HBV感染诱发HCC的可能机理（NatRevCancer. 2006Sep;6（9）:

674-687）

1.2.2HBV编码病毒蛋白在肝癌形成中的作用

已知HBV基因组包含四个开放阅读框（ORF），编码七个病毒蛋白，包括：

包膜蛋白基因（preS1/HBx/S-ORF）编码的三个表面抗原（preS1,HBx,HBs）；衣壳蛋白基因（preC/C-ORF）编码的核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg）；聚合酶基因（P-ORF）编码的带有反转录酶功能的聚合酶蛋白（HBp）；由X基因（X-ORF）编码的X蛋白（HBx）[10]。

HBV编码的病毒蛋白在肝癌的形成过程中发挥着重要作用。

ChisariFV和Hildt E通过HBx、HBs转基因小鼠，发现在20个月内自发形成HCC，充分证明了病毒蛋白在HCC形成中的重要作用[11,12]；由于HBV转基因鼠天然免疫耐受，在不经历慢性炎症的情况下自发形成HCC，首次提出了HBV编码病毒蛋白能直接诱导HCC形成的假说[13,14]。

HBx通过激活细胞生长信号通路，如Wnt/beta-catenin和Ras/Raf/MAPK，促进肝细胞恶性转化和增殖[15]；HBs及其截短体蛋白在内质网堆积，导致内质网应激反应过度，形成氧自由基，致使基因组DNA不稳定，从而促进肝癌的形成[16]；HBc通过抵抗TRAIL诱导的肝细胞凋亡，促进肝细胞增殖[17]。

目前为止，HBV致HCC的机制还不是很清楚。

因此，阐明HBV编码病毒蛋白如何调控宿主基因的表达及其在致HCC中发挥的作用将对于揭示HBV的致癌机理有着重要意义，同时也将为HCC的治疗提供新的干预靶点。

1.2.3IIA型磷脂酶A2的研究进展

磷脂酶A2（PLA2）是一大的酶类，能催化水解磷脂Sn-2位脂键，产生自由脂肪酸和溶血磷脂，在脂类代谢及合成多种生物活性的物质——如花生四烯酸、前列腺素、白三烯、血栓素等生理病理过程中发挥重要作用，广泛参与了生物体内多种重要生理和病理过程[18]。

PLA2G2A是PLA2的成员之一，属于分泌型蛋白，其相对分子质量大小约为13kDa～15kDa，由122个氨基酸残基组成，有7对二硫键，结构稳定。

它广泛存在于哺乳动物的多种组织中，如肺、胸腺、肝、肾脏、前列腺、肠、胎盘、关节滑液和血液等。

PLA2G2A与炎症反应、免疫反应、抗血栓形成、细胞增殖、缺血性损伤及变态反应密切相关[19]。

近年来有研究表明，PLA2G2A与某些肿瘤的发生和发展有密切关系，如前列腺癌、消化道肿瘤、肺癌和胃癌等，这引起了肿瘤研究领域的广泛关注[6]。

Jiang等利用免疫组化的方法检测了74例前列腺组织、79例前列腺上皮瘤变和78例前列腺癌中PLA2G2A的表达情况，发现前列腺癌和高分化的上皮瘤变中PLA2G2A表达高于低分化的上皮内瘤变和正常前列腺癌组织[20]。

Kashiwagi等采用Northernblot和免疫组化检测58例胰腺癌患者术后标本和正常对照PLA2G2A的表达情况，结果显示PLA2G2A在65%胰腺癌中高表达，而在正常组织中仅存在于部分腺泡和导管细胞中[21]。

在结直肠癌中，Avoranta等发现，PLA2G2A在恶性结直肠肿瘤含量显著低于直肠腺瘤[22]。

Dong等证实PLA2G2A在肺癌组织表达升高，且其表达水平与肿瘤分级及预后密切相关，PLA2G2A表达高的肺癌患者预后更差[23]。

PLA2G2A可以刺激肿瘤细胞的生长，其产物花生四烯酸导致前列腺肿瘤细胞增殖，促进肿瘤血管生成和转移[24]。

与之相反，PLA2G2A基因沉默的胃癌细胞的侵袭能力增强，且高表达PLA2G2A的胃癌患者5年生存率明显提高[25]。

目前为止，PLA2G2A在肝癌发生和发展中的生物学功能尚未有研究。

前期的工作中我们采用基因芯片筛选了慢性HBV患者肝癌组织及其相应癌旁组织的差异表达基因，发现PLA2G2A在癌组织中较癌旁组织高，提示PLA2G2A可能在HBV致HCC形成中发挥重要作用，然而，PLA2G2A在HBV相关癌组织中表达上调的机制及其在肝癌发生发展中的作用尚不清楚。

HBV 诱导的PLA2G2A 表达是通过哪个病毒蛋白发挥作用？

其调节机制如何？

PLA2G2A在HBV诱发肝癌发生和发展过程中如何发挥作用？

尚待进一步研究。

1.3本课题的假设

综合分析我们前期工作，发现：

①HBV能够上调PLA2G2A的表达，慢性乙肝患者PLA2G2A血清学水平较健康对照高，PLA2G2A促进HBV的复制；②HBV相关肝癌组织中PLA2G2A表达显著高于癌旁；③PLA2G2A促进细胞集落的形成，提示PLA2G2A可能参与了HBV致HCC的形成（见工作基础部分）。

根据以上初步实验结果，不难发现一个非常有趣的相互关系网，即：

HBV感染引起肝细胞内异常表达某些特定细胞因子和胞内蛋白，如PLA2G2A等，而这些特定蛋白与肝癌的形成和发展存在一定相关性，并且其中一些蛋白（如PLA2G2A）的异常表达又会促进HBV在细胞内的复制水平，两者形成一种正反馈调节关系。

如下图。

与此类似的两个或多个因子正反馈调节促进组织生长或疾病发生已有报道。

Ansel等于2000年提出了著名的淋巴滤泡生成正反馈调节假说认为：

BLC（B-lymphocytechemoattractant）与membreanelymphotoxinα1β2正反馈促进淋巴滤泡生成和成熟[27]。

因此，我们根据已有理论和初步实验结果，提出了HBV感染与PLA2G2A异常表达之间这种“正反馈调节”诱发HCC的假说：

HBV可能通过诱导某些细胞因子和蛋白（如PLA2G2A）的异常表达来参与肝细胞多种恶性生物学表型的调控,而PLA2G2A的异常表达又将促进HBV在肝细胞内的复制[21], 这种“正反馈调节”可能是HBV诱发HCC的机制之一。

1.4本项目相关研究

在前期工作基础上，本课题拟：

①通过ELISA，免疫组化、RT-PCR和western blot等实验检测PLA2G2A在HBV相关疾病中的表达，分析其与疾病进程，病理分期和预后的相关性；②通过截短和定点突变的萤光素酶报告基因实验、凝胶电泳迁移实验（EMSA）、染色质免疫共沉淀（CHIP）实验等检测病毒蛋白激活的信号转导途径和诱导入核的转录因子，探讨HBV病毒蛋白在转录水平诱导PLA2G2A表达的分子机制；③通过流式细胞仪分析转染PLA2G2A真核表达载体后细胞周期的影响，检测PLA2G2A超表达对肝细胞的转化能力。

研究结果不仅有助于完善HBV调控宿主信号网络分子机理，同时也为临床诊断和治疗乙肝相关肝癌及预后监测提供全新的思路。

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1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 

研究目标:

在前期工作的基础上，通过临床标本检测，分析PLA2G2A的表达与HBV相关肝癌的关系；探讨HBV调控PLA2G2A表达的分子机制；研究PLA2G2A在细胞水平的致瘤能力，阐明HBV诱导PLA2G2A表达正反馈促进肝癌形成的分子机制，通过上三个层面的研究不仅有助于完善病毒蛋白调控宿主信号网络的分子机理，同时为临床治疗乙肝相关肝癌及预后监测提供理论基础。

研究内容：

1PLA2G2A的表达与乙肝相关肝癌的相关性的研究：

（1）收集健康对照和乙肝患者（包括慢性乙肝患者、肝纤维化患者和肝癌患者）的血清样本，ELISA检测

   PLA2G2A的血清学水平。

（2）收集乙肝相关肝癌组织及其配对的癌旁组织，比较PLA2G2A在两者表达水平的差异。

（3）分析乙肝相关肝癌组织中PLA2G2A的表达与肿瘤大小、病理分期、临床分期、转移及其预后之间的相关

   性。

2HBV对PLA2G2A表达的影响及其分子机制研究：

（1）HBV对PLA2G2A表达的影响

①比较正常肝细胞、HBV感染的肝癌细胞和无HBV感染的肝癌细胞中PLA2G2A的表达水平。

②构建HBV的感染性克隆，探讨其对PLA2G2A表达的影响。

（2）HBV调节PLA2G2A表达的分子机制研究

①构建HBV各个基因的真核表达质粒，探讨调节PLA2G2A表达的病毒元件。

②构建PLA2G2A基因启动子荧光素酶报告基因及其系列截短启动子，运用定点突变原理，寻找与病毒元件相

  互作用的核转录因子，探讨病毒元件调节该转录因子可能的上游信号通路。

3PLA2G2A转化细胞能力的研究

①构建PLA2G2A的真核表达质粒，分析其对细胞周期、细胞增殖的影响，检测PLA2G2A超表达对上述细胞的转

  化能力。

②采用Barlogie细胞周期分析法，测定细胞增殖指数；流式细胞术结合免疫荧光的方法，检测Ki-67和CD71

  等细胞增殖性抗原的表达情况。

③采用软琼脂集落实验检测PLA2G2A基因转化细胞的能力。

拟解决的关键科学问题:

筛选调控PLA2G2A表达的病毒蛋白是本项目的关键：

通过荧光素酶报告基因系统筛选调控PLA2G2A表达的HBV病毒元件，寻找与病毒元件相互作用的核转录因子，探讨病毒元件激活该转录因子可能的上游信号通路。

2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 

研究方法:

1PLA2G2A的表达与乙肝相关肝癌的相关性的研究

1.1PLA2G2A与HBV相关疾病进程的关系

（1）收集武汉大学人民医院住院和门诊乙肝患者（包括慢性乙肝患者、肝纤维化患者和肝癌患者）的血清，详细记录病人的病例信息，包括各项体征、生化和血常规检测指标，同时收集健康体检人群的血清作为正常对照组。

（2）采用ELISA检测乙肝患者组和健康对照组PLA2G2A的血清学水平，统计学软件SPSS16.0分析各组人群PLA2G2A水平的差异，p<0.05为有显著性差异。

1.2PLA2G2A与病毒蛋白表达的相关性

收集武汉大学人民医院50例乙肝病史患者的肝癌患者癌组织和配对癌旁组织，液氮冻存。

（1）RT-PCR和Westernblot分别检测病毒蛋白和PLA2G2A表达的变化。

（2）RT-PCR和Westernblot检测PLA2G2A调控靶基因如HIF-1α、P53、MMP-2、MMP-9和VEGF等表达变化。

1.3PLA2G2A与HBV致HCC疾病的相关性

收集武汉大学人民医院2005-2015年行肝部分切除术的乙肝相关肝癌患者的病理切片及相关资料。

（1）收集石蜡切片，采用免疫组