手足口病预防控制指南版.docx

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手足口病预防控制指南版

手足口病预防控制指南（2009版）

手足口病（Hand-foot-mouthDisease,HFMD）是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，是我国法定报告管理的丙类传染病。

大多数患者症状轻微，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。

少数患者可出现无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。

手足口病常出现暴发或流行，为指导各地做好手足口病的预防控制工作，制定本指南。

一、目的

（一）指导医疗机构、疾病预防控制机构开展疫情报告与监测。

（二）指导疾病预防控制机构开展流行病学调查、病原学监测。

（三）指导疾病预防控制机构、医疗机构开展重点场所及公众预防控制工作。

二、疾病概述

（一）病原学。

引起手足口病的病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属，包括柯萨奇病毒A组（CoxasckievirusA,CVA）的2、4、5、7、9、10、16型等，B组（CoxasckievirusB,CVB）的1、2、3、4、5型等；肠道病毒71型（HumanEnterovirus71,EV71）；埃可病毒（Echovirus,ECHO）等。

其中以EV71及CVA16型较为常见。

肠道病毒适合在湿、热的环境下生存与传播，75%酒精和5%来苏不能将其灭活，对乙醚、去氯胆酸盐等不敏感；对紫外线和干燥敏感，各种氧化剂（高锰酸钾、漂白粉等）、甲醛、碘酒以及56℃30分钟可以灭活病毒。

病毒在4℃可存活1年，-20℃可长期保存，在外环境中可长期存活。

（二）流行病学。

1．传染源。

人是人肠道病毒的唯一宿主，患者和隐性感染者均为本病的传染源，隐性感染者难以鉴别和发现。

发病前数天，感染者咽部与粪便就可检出病毒，通常以发病后一周内传染性最强。

2．传播途径。

肠道病毒可经胃肠道（粪-口途径）传播，也可经呼吸道（飞沫、咳嗽、打喷嚏等）传播，亦可因接触患者口鼻分泌物、皮肤或粘膜疱疹液及被污染的手及物品等造成传播。

尚不能明确是否可经水或食物传播。

3．易感性。

人对人肠道病毒普遍易感。

不同年龄组均可感染发病，以5岁及以下儿童为主，尤以3岁及以下儿童发病率最高。

显性感染和隐性感染后均可获得特异性免疫力，产生的中和抗体可在体内存留较长时间，对同血清型病毒产生比较牢固的免疫力，但不同血清型间鲜有交叉免疫。

4．流行特征。

该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5-7月为发病高峰。

托幼机构等易感人群集中单位可发生暴发。

肠道病毒传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，控制难度大，容易出现暴发和短时间内较大范围流行。

（三）临床表现。

手足口病潜伏期为2-10天，平均3-5天，病程一般为7-10天。

急性起病，发热，口腔粘膜出现散在疱疹，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，疱疹周围可有炎性红晕，疱内液体较少。

可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等症状。

部分患者无发热，仅表现为皮疹或疱疹。

一般预后良好；少数病例，特别是EV71感染患儿，可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、神经源性肺水肿、循环障碍等，病情凶险，可致死亡或留有后遗症。

（四）治疗原则。

目前无特异性治疗方法，以支持疗法为主，绝大多数患者可自愈。

目前尚无特异性的疫苗。

病例的治疗方法参考卫生部《手足口病诊疗指南（2008年版）》。

三、病例定义

（一）临床诊断病例。

在流行季节发病，常见于学龄前儿童，婴幼儿多见。

1．普通病例：

发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热。

2．重症病例：

出现神经系统受累、呼吸及循环功能障碍等表现，实验室检查可有外周血白细胞增高、脑脊液异常、血糖增高，脑电图、脑脊髓磁共振、胸部X线、超声心动图检查可有异常。

极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合实验室检测做出诊断。

若无皮疹，临床不宜诊断为手足口病。

（二）实验室确诊病例。

临床诊断病例符合下列条件之一者，即可诊断为实验室确诊病例：

1．自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子、脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本中分离到人肠道病毒（指包括CVA16和EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）。

2．自咽拭子或咽喉洗液、粪便或肛拭子等标本中检测到CVA16或EV71特异性核酸，或从脑脊液、疱疹液、血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本等标本中检测到人肠道病毒（指包括CVA16和EV71等有明确证据表明可以导致手足口病的人肠道病毒）的特异性核酸。

3．血清标本人肠道病毒型特异性中和抗体滴度≥1∶256，或急性期与恢复期血清肠道病毒特异性中和抗体有4倍或4倍以上的升高。

（三）聚集性病例。

1周内，同一托幼机构或学校等集体单位发生5例及以上手足口病病例；或同一班级（或宿舍）发生2例及以上手足口病病例；或同一自然村发生3例及以上手足口病病例；或同一家庭发生2例及以上手足口病病例。

四、疾病监测

（一）疫情报告。

1．个案报告。

各级各类医疗机构应按照《中华人民共和国传染病防治法》和《传染病信息报告管理规范》的有关规定，对符合病例定义的手足口病病例进行报告。

如为重症病例，请在“重症患者”处选择“是”；如为实验室诊断病例，请在“实验室结果”处选择相应的肠道病毒病原学分型信息。

实行网络直报的医疗机构应于24小时内进行网络直报，未实行网络直报的医疗机构应于24小时之内寄送出传染病报告卡。

2．聚集性病例报告。

托幼机构和学校、医疗机构发现手足口病聚集性病例时，应以最快的方式向县（区）级疾病预防控制机构报告。

3.突发公共卫生事件报告。

局部地区或集体单位发生流行或暴发时，按照《突发公共卫生事件应急条例》、《全国突发公共卫生事件应急预案》、《突发公共卫生事件与传染病疫情监测信息报告管理办法》及有关规定，及时进行突发公共卫生事件信息报告。

（二）病原学监测。

各省区市卫生行政部门要组织医疗卫生机构开展病原学监测，了解病原动态分布变化。

所有重症和死亡病例均需采样。

此外，以县（区）为单位，每月最少需采集5例首次就诊的普通病例标本；当月县（区）病例总数少于5例时，全部采样。

以省（区、市）为单位,在手足口病流行年份中每年至少采集20对EV71和10对CVA16感染的手足口病患儿的双份血清,以阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。

以省（区、市）为单位，每月至少从手足口病病例中分离10株毒株并做血清型别鉴定，鉴定完成后并将毒株及鉴定结果于5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心。

具备测序条件的省份，可开展VP1基因序列测定和分析，进行基因定型，序列测定完成后将序列结果于5个工作日内报送至中国疾病预防控制中心；不具备测序条件者，将毒株送至中国疾病预防控制中心进行序列测定，中国疾病预防控制中心要于28个工作日内反馈基因定型结果。

所有病例的采样均由医疗机构完成，及时送至县（区）级疾病预防控制机构或指定的检测机构检测。

检测机构将实验室检测结果于24小时内反馈给县（区）级疾病预防控制机构；县（区）级疾病预防控制机构接到结果后，于24小时内对检测病例的传染病报告卡信息进行订正，将其病例类型订正为“实验室诊断”，并在“实验室结果”处补填肠道病毒病原学分型信息。

各种标本采集和检测方法详见《手足口病标本采集及检测技术方案》（附件1）。

（三）监测信息分析与反馈。

各级疾病预防控制机构要每日对网络直报系统进行浏览，及时对报告的病例进行审核、查重、订正等工作，定期对监测数据进行分析，判断发病趋势，发现异常升高或病例呈聚集性分布或出现重症及死亡病例时，要及时核实并向同级卫生行政部门及上级疾病预防控制机构报告，并定期向下级疾病预防控制机构和医疗机构反馈疫情分析信息。

五、预防控制

（一）现场调查处置。

发现手足口病聚集性病例、重症或死亡时，县（区）级及以上疾病预防控制机构要立即组织开展现场调查处置。

1．流行病学调查。

（1）聚集性病例调查：

了解聚集性病例的临床表现、流行特征，以分析流行因素，为采取防控措施提供依据。

要对首发或指示病例开展流行病学调查，填写《手足口病个案调查表》（附件2）。

（2）重症或死亡病例调查：

详细了解病例的基本信息、临床症状、发病就诊治疗过程、感染传播情况、病原检测结果，以分析重症及死亡病例的主要危险因素，填写《手足口病重症或死亡病例个案调查表》（附件3）。

调查结束后，各省级疾病预防控制中心应将结果录入统一数据库，报送中国疾病预防控制中心。

（3）专题调查：

根据当地手足口病疫情特点及流行特征，可开展专题调查，以了解当地的主要传播方式以及感染危险因素等，为制定干预措施提供依据。

专题调查的方案及其内容，应根据调查目的专门设计。

（4）医疗机构要协助疾病预防控制机构对病例进行流行病学调查。

2．传染源的管理。

患儿应及时就医，并遵医嘱采取居家或住院方式进行治疗。

居家患儿，家长或监护人应在社区（村）医生的指导下，密切关注患儿的病情变化，如发现神经系统、呼吸系统、循环系统等相关症状时，应立即送医院就诊，同时，要尽量避免与其他儿童接触。

住院患儿应在指定区域内接受治疗，防止与其他患儿发生交叉感染。

管理时限为自患儿被发现起至症状消失后1周。

乡镇卫生院/社区卫生服务中心、村卫生室/社区卫生服务站等负责本辖区居家治疗的手足口病患儿的随访工作，掌握居家治疗患儿的病情进展情况。

3．标本采集和检测。

（1）所有重症和死亡病例均要采集标本，可以采集咽拭子、粪便或肛拭子、疱疹液、脑脊液、血清等，死亡病例还可采集脑、肺、肠淋巴结等组织标本。

聚集性病例至少要采集2例病例标本开展病原学检测。

（2）医疗机构负责样本采集，疾病预防控制机构应指导医疗机构进行相关生物学标本的采集。

（3）疾病预防控制机构根据本地的技术能力，对采集的标本开展核酸检测、病毒分离；不具备技术条件时，及时送上级机构进行检测（附件1）。

4．消毒措施。

病家、托幼机构和小学的消毒应在当地疾病预防控制机构的指导下，由单位及时进行消毒，或由当地疾病预防控制机构负责对其进行消毒处理。

医疗机构的消毒由医疗机构安排专人进行。

消毒方法参见《消毒技术规范》（2002版）和《手足口病疫源地消毒指南》（附件4）。

5．健康教育。

各级医疗卫生机构应在政府领导下，与当地教育、宣传、广电等部门密切合作，充分利用12320公共卫生公益热线、广播、电视、报纸、网络、手机短信、宣传单/宣传画等多种方式，开展手足口病防治知识的宣传工作，使5岁以下儿童家长及托幼机构工作人员等了解手足口病的临床症状，掌握最基本的预防措施，强调保持良好的个人卫生习惯及环境卫生措施对于有效预防手足口病的重要性，动员托幼机构老师和管理人员、儿童家长成为手足口病防控工作的主动参与者，形成群防群控。

与重症或死亡病例发病前1周或发病后有共同生活、居住史的5岁以下儿童，要对其家长或监护人进行健康教育，做好儿童的密切观察，出现症状要及时就诊和治疗。

（二）重点人群及重点机构的预防控制措施。

为降低人群手足口病的发病率，减少聚集性病例，避免医院感染，各地要做好以散居儿童为主的重点人群和以托幼机构、医疗机构为主的重点场所的预防控制工作。

1．散居儿童的预防控制措施。

（1）饭前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等给儿童洗手；看护人接触儿童前、替幼童更换尿布、处理粪便后均要洗手；

（2）婴幼儿的尿布要及时清洗、曝晒或消毒；注意保持家庭环境卫生，居室要经常通风，勤晒衣被；

（3）婴幼儿使用的奶瓶、奶嘴及儿童使用的餐具使用前后应充分清洗、消毒；不要让儿童喝生水、吃生冷食物；

（4）本病流行期间不宜带儿童到人群聚集、空气流通差的公共场所；避免接触患病儿童；

（5）儿童出现发热、出疹等相关症状要及时到医疗机构就诊；

（6）居家治疗的患儿避免与其他儿童接触，以减少交叉感染；父母要及时对患儿的衣物进行晾晒或消毒，对患儿粪便及时进行消毒处理。

2．托幼机构预防控制措施。

（1）每日进行晨检，发现可疑患儿时，要采取立即送诊、居家观察等措施；对患儿所用的物品要立即进行消毒处理；

（2）出现重症或死亡病例，或1周内同一班级出现2例及以上病例，建议病例所在班级停课10天；1周内累计出现10例及以上或3个班级分别出现2例及以上病例时，经风险评估后，可建议托幼机构停课10天；

（3）教育、指导儿童养成正确洗手等良好的卫生习惯；老师要保持良好的个人卫生状况；

（4）教室和宿舍等场所要保持良好通风；定期对玩具、儿童个人卫生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品进行清洗消毒；

（5）定期对活动室、寝室、教室、门把手、楼梯扶手、桌面等物体表面进行擦拭消毒；

（6）托幼机构应每日对厕所进行清扫、消毒，工作人员应戴手套，工作结束后应立即洗手；

（7）托幼机构应配合卫生部门采取手足口病防控措施。

3．医疗机构的预防控制措施。

（1）各级医疗机构应加强预检分诊，专辟诊室（台）接诊发热、出疹的病例。

增加候诊及就诊等区域的清洁消毒频次，室内清扫时应采用湿式清洁方式；

（2）医务人员在诊疗、护理每一位病例后，均应认真洗手或对双手消毒，或更换使用一次性手套；

（3）诊疗、护理手足口病病例过程中所使用的非一次性仪器、体温计及其他物品等要及时消毒；

（4）对住院患儿使用过的病床及桌椅等设施和物品必须消毒后才能继续使用；

（5）患儿的呼吸道分泌物和粪便及其污染的物品要进行消毒处理。

附件：

1．手足口病标本采集及检测技术方案

2．手足口病个案调查表

3．手足口病重症或死亡病例个案调查表

4．手足口病疫源地消毒指南

附件1

手足口病标本采集及检测技术方案

一、采集标本的种类、保存和运输

（一）粪便标本。

采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。

粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

（二）咽拭子标本。

采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。

用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。

4℃暂存并在12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

（三）血清标本。

各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。

采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。

静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。

将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。

（四）疱疹液。

在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。

先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

（五）肛拭子标本。

采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。

用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有3－5ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。

（六）尸检标本。

采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。

每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

（七）脑脊液标本。

出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。

采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。

采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。

临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。

依照《人间传染的病原微生物名录》，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。

可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。

在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。

在上送标本的同时，需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》。

二、标本采集注意事项

在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。

用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。

用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。

为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。

不能立即检测的标本应冷冻保存。

对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。

标本保存液的配置见下表：

保存液

Eagle`s液（MEM）

80.5ml

3%L-谷氨酰胺200mM

1.0ml

胎牛血清

5.0ml

7.5%NaHCO3溶液

3.5ml

青、链霉素

（各10000U/ml）

10ml

三、实验室检测操作流程

（一）病毒分离。

1.试剂配置

（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：

生长液（GM）

维持液（MM）

Eagle`s液（MEM）

86.5ml

92.5ml

3%L-谷氨酰胺200mM

1.0ml

1.0ml

胎牛血清

10.0ml

2.0ml

7.5%NaHCO3溶液

2.5ml

3.5ml

青、链霉素

（各10000U/ml）

1.0ml

1.0ml

（2）粪便标本和肛拭子的处理液

完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100μg/ml。

完全PBS液的配置：

取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。

A液：

试剂品名

加入量

NACL

8.00g

KCL

0.20g

Na2HPO4（无水）

0.91g

KH2PO4

0.12g

用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。

B液：

试剂品名

加入量

MgCl2.6H2O

0.10g

溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

C液：

试剂品名

加入量

CaCl2

0.10g

溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

2．病毒分离细胞系

许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。

对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：

ØRD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。

ØHEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。

3．标本的处理

（1）粪便标本和肛拭子的处理

操作步骤：

1）在离心管上标记标本号；

2）每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；

4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；

5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；

6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；

7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；

8）1管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另1管存于4-8℃以备接种。

（2）疱疹液标本的处理

疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。

（3）脑脊液标本的处理

脑脊液标本通常直接用于病毒分离。

（4）咽拭子标本的处理

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。

然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。

如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。

4．接种和观察（病毒分离）

（1）通常使用８ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。

显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。

一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；

（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；

（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；

（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；

（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃。

（或者使用吸附的方法接种病毒：

接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36℃；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。

同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。

（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；

（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+—4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%;2+,25%-50%;3+,50%-75%;4+,75%-100%）；

（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代；

（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；

（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。

因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；

（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。

（注意：

同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：

不同细胞的培养物应单独传代）；

（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；

（13）注意：

如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。

取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；

（14）几个概念：

A：

毒性反应：

如果在接种后1-2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。

这些已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。

如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种