类弹性蛋白的分子设计非色谱纯化及分子动力学模拟硕士学位论文 精品.docx

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类弹性蛋白的分子设计非色谱纯化及分子动力学模拟硕士学位论文精品

硕士学位论文

类弹性蛋白的分子设计、非色谱纯化及分子动力学模拟

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DissertationSubmittedtotheAcademicDegreeCommitteeof

HuaQiaoUniversity

Moleculardesign,non-chromatographicpurificationanddynamicssimulationsofelastin-likepeptides

By

KaizongHuang

InCandidacyfortheMaster’sDegreeof

BiochemistryandMolecularBiology

Supervisedby

AssistantProfessorGuang-yaZhang

HuaQiaoUniversity

November2011

摘要

类弹性蛋白多肽（Elastin-likepolypeptides，ELPs），是一种非常重要的具有弹性功能的，且对环境温度有很大敏感性的生物高分子，利用类弹性蛋白的可逆相变特性，使其在蛋白纯化、作为药物载体、组织工程等方面得到广泛的应用。

ELPs的相变温度是定量描述其相变温度性质最便利的参数，通过相变温度实测值探讨与其序列组成、每一单体的Xaa数量、浓度等因素间的关系具有重要意义。

将伪氨基酸组成中的的相关系数部分作为类弹性蛋白的特征向量，从类弹性蛋白序列出发，利用最小中位方差回归，找出其序列相关系数的最佳阶数。

运用均匀设计分别对支持向量机与BP神经网络参数进行优化，并进行交叉验证，结果表明BP神经网络获得的预测模型最佳，其绝对误差为0.39℃，均方根误差为0.89℃.

从头设计了类弹性蛋白多肽的序列并人工合成其编码基因片段，克隆至改造后的表达载体pET-22b中，构建重组表达载体，转化于大肠杆菌BL21（DE3）中并诱导表达，采用可逆相变循环经高速离心对其进行纯化，利用SDS-PAGE与色氨酸标准曲线对ELPs进行分析与定量，并考察了五种阴离子与三种阳离子及浓度对类弹性蛋白相变温度的影响。

结果表明：

0.4mM的Na2CO3能使25µMELP[KV8F-20]相变温度降低至19℃，此ELPs序列有望开发成一新型纯化标签，为今后重组蛋白的非色谱分离纯化奠定基础。

通过分子动力学模拟探讨类弹性蛋白ELPs发生可逆相变（ITT，inversetemperaturetransition）的分子机理及预测ELP[KV8F-20]的相变温度。

随着温度的升高，类弹性蛋白经历可逆相变，由舒展的构象过渡到折叠构象。

在300K~400k间5个不同的温度下，对ELP[KV8F-20]在水溶液与1M的NaCl溶液各进行9ns的模拟。

模拟过程中，ELP[KV8F-20]在水溶液与1M的NaCl溶液均发生疏水缩聚，推断在水溶液条件下，ELP[KV8F-20]在375K时发生相变，400K时ELPs已经变性；在水溶液条件下，ELP[KV8F-20]在350K时发生相变，375K时ELPs已经变性。

通过分析，推断疏水作用与结合水的减少在ELP[KV8F-20]的相变过程中起到关键作用。

此外，比较不同温度下蛋白的缩聚程度，并结合实验结果，推断出蛋白的相变温度在102℃左右。

本论文完成了一次从ELPs的相变温度预测到基因的从头合成并表达的过程，考察不同种盐对ELP[KV8F-20]相变温度的影响.使用NAMD对ELP[KV8F-20]进行分子动力学模拟，并与实验结果结合，完成了一次ELPs相变机理及盐离子降低相变温度机理的探讨。

总结了相关结论，这可为今后利用ELPs纯化重组蛋白提供经验积累和理论依据。

关键词：

类弹性蛋白多肽，相变温度，非色谱纯化，分子动力学模拟，相变机理

Abstract

Elastin-likepolypeptides（Elastin-likepolypeptides,ELPs）areelasticityandenvironmentallyresponsivebiopolymers.Duetotheirreversiblephasetransitioncharacteristic,Elastin-likepolypeptides（ELPs）havebeenusedforanumberofapplications,suchasproteinpurification,drugdelivery,andtissueengineering.

FortheELPs,thetransitiontemperature（

）isthemostconvenientparametersforquantificationaldescriptionoftheELPproperties.Itisofgreatimportancetoexploretherelationshipbetweenthetransitiontemperatureandthesequencecharacteristics,thenumberofXaaofeachmonomerandtheconcentrationofELP.Thebestorderofthecorrelationcoefficientforpseudo-aminoacidcompositionwasobtainedbyusingLeastMedianofSquaresRegressionfromsequence.Theuniformdesignwasusedtooptimizetherunningparametersandleave-oneoutcross-validationwascarriedouttoevaluatethemodelofbackpropagationneuralnetwork（BPNN）andsupportvectormachines,respectively.TheresultsshowedthatthepredictedmodelobtainedbyBPNNwasthebest,ofwhichthemeanabsoluteerrorandrootmeansquarederrorwas0.39℃and0.89℃,respectively.

Then,wedenovodesignedanovelELPsgeneandcloneditintothemodifiedexpressionvectorpET-22b.Then,wetransformedtherecombinantexpressionvectorpET-22b-ELPsintoEscherichiacoliBL21（DE3）.UponinductionbyIsopropylβ-D-Thiogalactoside（IPTG）,ELPswasexpressedandpurifiedbyanon-chromatographicpurificationmethodnamedinversetemperaturecycling.TheinfluencesofsaltstypesandconcentrationsonELPswerealsodetermined.TheresultsshowedthatthetransitiontemperatureoftheELP[KV8F-20]decreasedto19℃by0.4mmol/LNa2CO3.Duetoitssmallmolecularweightandsensitivitytosalt,theELPsmightbeausefulpurificationtag,whichcanprovideareliableandsimplenon-chromatographicmethodforpurificationoftherecombinantproteinbyinversetransitioncycling.

Finally，weconcernedonthemolecularmechanismforITT（Inversetemperaturetransition）ofELPs（elastin-likepeptides），andpredictionforthetransitiontemperatureofELP[KV8F-20].Asthetemperatureincreased,ELPsundergoeschangingfromaextendedtofoldedconformation.Moleculardynamicsimulationswereperformed9nsinexplicitwaterand1MNaClsolutionforELP[KV8F-20]atfivedifferenttemperaturebetween300Kand400K.Duringsimulationprocessing,ELP[KV8F-20]hadhydrophobiccollapseinexplicitwaterand1MNaClsolution.Accordingtosimulationresult,weconcludedthatELP[KV8F-20]hadundergonephasetransitionatthe375Kandsufferedfromdenaturalizationat400KwhentheELP[KV8F-20]wasininaqueoussolutions;ELP[KV8F-20]hadundergonephasetransitionatthe350Kandsufferedfromdenaturalizationat375KwhentheELP[KV8F-20]wasin1MNaClsolutions.WebelievedthathydrophobiccollapseanddecreasingquantityofcombinationalwaterplayedakeyroleforITT.Ataddition,analyseddegreeofhydrophobiccollapseatdifferenttemperature,andcombiningwithexperimentresult,whichindicatedthetransitiontemperatureforELP[KV8F-20]isabout102℃.

Inthispaper,wecompletedpredictingthetransitiontemperatureofELPs,anddenovosynthesisandexpressedaELPsgene（ELP[KV8F-20]）,determinedeffectionofdifferentkindsofsaltontransitiontemperatureforELP[KV8F-20].DidmoleculardynamicssimulationsontheELP[KV8F-20]byNAMD,whoseresultcombinedwithexperimentalresults,discussedmechanismthattheELPsundergoneInversetemperaturetransitionanddecreasedtransitiontemperaturebyNaCl.OurresultscanprovidethetheoreticalbasisofexperienceaboutusingELPstagtopurifytherecombinantprotein.

Keywords:

elastin-likepeptides；transitiontemperature；non-chromatographicpurification;moleculardynamicssimulations;transitionprinciple

第一章绪论

1.1类弹性蛋白多肽的概述

1.1.1类弹性蛋白多肽简介

类弹性蛋白多肽（Elastin-likepolypeptides，ELPs）是一种具有弹性功能且对环境温度非常敏感的人造基因工程蛋白质聚合物。

其结构主要由五肽重复序列单元构成，即（Val-Pro-Gly-Xaa-Gly,VPGXG），源自于弹性蛋白的疏水区域，其中Xaa可以是除Pro以外任一氨基酸[1]。

ELPs有一个可逆相变过程，称之为反转变温度（inversetemperaturetransition，ITT），若环境温度低于该相变温度（transitiontemperature，

），该多肽在水溶液中为高度可溶，聚合物链保持无序结构，且相当伸展。

相反，当温度高于时，该含水的多肽链结构就瓦解，并开始聚集，形成一个富含ELPs的聚集物。

利用类弹性蛋白的可逆相变特性,使其在蛋白纯化、作为药物载体、组织工程等方面得到广泛的应用[2]

1.1.2类弹性蛋白多肽的相变机理

相变过程是ELPs在水溶液中絮聚的过程，伴有伸展型多肽链的瓦解并与溶液相分离[3-4]。

从构象变化上，Urry认为（VPGVG）重复单元在Pro-Gly处结构为β-转角（β-turn），而重复的β-转角形成右手螺旋的β-螺旋（right-handedhelixtermedβ-spiral），而β-螺旋可用来解释

效应与△

机理（

-effect与△

mechanism）；在分子水平上，当温度高于

时，部分较为伸展且无序的构象转变成较为紧凑的β-螺旋[5-6]。

Dybal[7]认为发生相变时，在Pro与Val残基处会形成β（II）-转角；但Gross[8]等认为，在整个相变的过程中，聚合五肽（GVGVP）n并不存在β-螺旋构像，而β-折叠（β-sheets）则是其最基本的规则构象（thebasicregularpartofconformation）；Serrano等[9]研究表明升高温度会使得β-螺旋聚集在一起，在1℃的相变温度范围内，他们观测到有25％的氨基酸在链内形成了β-折叠。

Urry从振动熵的形成及疏水性聚集两方面来阐述（GVGVP）n的相变机理。

在（GVGVP）n疏水区域内有序体运动链节会产生相互作用，由于疏水区域内部运动链的阻尼作用，疏水性区域聚集会引起振动熵的上升，疏水性区域聚集的发生是伴随着蛋白疏水部位共振，而温度在一定范围内上升时有助于疏水作用加强。

在相变发生时，增加温度会使在水环境中的聚合物有序性得到加强，而包围在疏水性残基的有序水分子变成无序状态，此时疏水性基团将与水溶液相分离，结果在整个变化过程中是趋于无序性的，这与热力学第二定律相吻合[10-11]。

从能量变化角度来看，相变过程是一个复杂多步的转变，在该转变过程中，某些步骤是吸热的，这可能与疏水性水合作用的损耗有关；而其它步骤均是放热的，结果导致ELPs多肽链以物理方式（范德华力）聚集在一起，但在这一过程中ELPs放热组份数量还不及吸热组份数量三分之一[12]。

1.1.3影响Tt的各种因素

1.1.3.1重复序列次数、浓度对Tt影响

MeyerDE等[13]利用递归定向连接（recursivedirectionalligation，RDL）技术，成功地表达出三种不同单体类弹性蛋白文库，结果发现，ELPs的

可作为其五肽重复序列次数的函数。

当五肽重复序列次数较少时，ELPs的

随重复序列的重复次数的增加而下降较明显，当五肽重复序列次数较大时，ELPs的

随重复序列重复次数的增加，其值变化不大。

MeyerDE等[14]分析ELP[V5A2G3]文库的

与ELPs浓度关系时，结果表明：

随着ELPs浓度的上升而下降，并且呈线性关系。

即

，

代表斜率，ELPs单体不同，其值也不相同，

为ELP浓度。

1.1.3.2Xaa对Tt的影响

LimDW等[15]在Xaa中选取可电离的Lys，与疏水的Phe相比，前者可以提高ELPs的盐敏感度以降低ELPs的

。

通常情况下，相似分子量的ELPs–[KV2F]家族的

比ELPs–[KV7F]家族要高16～42°C，这是因为ELPs–[KV2F]家族的赖氨酸含量比ELPs–[KV7F]家族高2倍以上。

1.1.3.3盐浓度对Tt的影响

对于所有的ELPs，

均随NaCl浓度增加而下降。

根据经验，每增加1M的NaCl浓度，

就相应地减少15℃左右。

然而，这种影响效应会随着ELPs分子中带电氨基酸的不同而变化，在溶解液中，ELPs的

的离子效应遵循霍夫迈斯特离子序（Hofmeisterseries）。

但有时一些盐离子可以提高

，例如胍盐[15]。

1.1.3.4分子量对ELPs的Tt影响

GirottiA等[16]对一系列的ELPs模型进行研究时发现，随着分子量下降，ELPs的

却逐渐上升。

ELPs的长度与聚合物的疏水性存在一个平衡，由于受到ELPs聚合物链末端的影响，这种影响对低分子量的ELPs的效应更大，如果ELPs分子量越低，疏水性就越小。

然而，这种链末端的极性并不能有效说明这一情况，GirottiA认为，分子量对

的影响更大部分取决于聚合物链内疏水性相互作用而产生的絮集作用。

因而，如果ELPs链比较短时，就降低了聚合物链内部疏水性相互作用的效率，所以絮集作用就受抑制。

1.1.3.5pH对Tt的影响

GirottiA等[16]通过实验表明，在相同ELPs浓度下，ELPs[（VPGVG）2VPGEG（VPGVG）2]n（n分别为5，9，15，30，45），它们的

均显示出相同的趋势：

当低于某一个给定的pH时，

值几乎保持常数，当高于这一特定的PH值时，

就迅速增加。

这一趋势可以这样解释：

由于pH增加，谷氨酸的γ-羧基团逐渐开始去质子化，去质子化导致其极性的增强，结果使得Tt向更高的温度转变，以上这些因素主要取决于ELPs的亲疏水性，而在带电的羧酸根附近不可能有这种水合状态（hydrationmode）。

1.1.3.6其它与Tt有关的因素

ELPs[KV2F-8]和ELPs[KV7F-9]，分别只有40和45个氨基酸，是到目前为止最短的ELPs纯化标签，这两种ELPs（freeELPs）是不能通过反相转换循环（InversetransitioncyclingITC）纯化出来，但这两种ELPs的融合蛋白是可以通过ITC被提纯的，因为ELPs的融合蛋白的

比纯粹的ELPs（freeELPs）的

低[14]。

ELPs的重复序列次数、浓度、Xaa、盐浓度、pH及分子量是影响类弹性蛋白

主要因素，由于ELPs是一种对环境有很大敏感性的生物高分子，影响类弹性蛋白

还有其它多种因素。

1.1.4类弹性蛋白多肽的合成方法

ELPs合成方式主要有两种：

一种是化学法，另一是基因重组合成法，后者为目前主流方法。

前者的优势是可以在ELPs序列特定的位点导入一些非天然氨基酸，但进行大规模生产却比较困难。

与化学合成法相比，使用基因重组合成法具有以下优势：

可通过基因模板控制ELPs序列、立体化学、分子量；且ELPs的转化菌株可以永久性生产ELPs；细胞内折叠机制可帮助ELPs折叠成正确的二级或三级结构[2]。

基因重组合成法更是由于RDL（recursivedirectionalligation，RDL）技术[13]的使用而被推向新的高度，其原理如图1所示。

使用基因重组合成法，并通过一系列条件优化后，ELPs的纯化产量可达1.6克/升[17]。

但使用重组的方法合成ELPs也有一些缺点：

由基因编码的ELPs存在一个很重要的滞后期（lead-time），这主要是由于需要在理想的载体中对基因进行组装及需要对宿主细胞进行优化表达所导致的[2]。

图1.1RDL技术的分子生物学步骤[13]

Fig1.1ThemolecularbiologystepsofRDL[13]

（续图1.1）（A）人工合成的ELPs单体基因插入到克隆载体中。

（B）ELPs单体基因序列的两端设计成可被两个限制性内切酶RE1与RE2（即分别为pflMΙ与BglΙ）识别的序列。

（C）分别用RE1与RE2的限制性内切酶酶切含有ELPs基因的克隆载体，产生含有RE1与RE2酶切后粘性末端的片段；用RE1酶切含有ELPs克隆载体，产生线性克隆载体。

（D）含有RE1与RE2酶切后粘性末端的片段与线性载体严格地进行头对尾连接。

（E）通过此方式，进行新一轮的ELPs基因序列延长[13]。

（A）Asyntheticmonomergeneisinsertedintoacloningvector.（B）Thegeneisdesignedtocontainrecognitionsitesfortwodifferentrestrictionendonucleases，RE1andRE2（pflMΙandBglΙrespectively），ateachofthecodingsequence.（C）AninsertispreparedbydigestionofthevectorwithbothRE1andRE2andsubsequentlyligatedintothevectorthathasbeenlinearizedbydigestionwithonlyRE1.（D）Theproductcontainstwohead-totailrepeatsoftheoriginalgene，withtheRE1