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1、实验步骤方法教材第一章 DNA及RNA实验第一节 组织和细胞RNA的制备1、样品处理：（1）培养细胞：悬浮细胞：收获细胞2-4106，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（2）贴壁细胞：将细胞弃去培养基，用冰浴的PBS洗涤一次，之后在培养皿中加入Trizol（以一个80-90%融合度的6cm培养皿加入1ml的Trizol为准），用枪吹打贴壁的细胞，待细胞完全吹打下来，转入1.5ml离心管中。（3）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70 及液氮中保存的均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。2、加入0.2ml氯仿，震荡

2、15s，静置2min，4离心，12000rpm15min，取上清。3、加入0.5ml异丙醇(或与上清等体积），将管中液体轻轻混匀，静置10min，4离心，12000rpm10min，弃上清。4、加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4，7500 rpm5min，弃上清。5、重复用乙醇洗涤一次。6、在室温中放置10min晾干，20-30ul加入适量的DEPC水溶解（65促溶10-15min）注意事项：1、细胞量和Trizol的加入量一定要按步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会是内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。2、在细胞加入Trizol裂解后，如近期不需要使用R

3、NA，可将Trizol裂解的细胞暂存于-80中。3、实验过程必须严格防止RNase的污染。提取RNA所使用的镊子、饭盒等需要经过高温烘烤后才可使用；RNA提取所使用的枪头、EP管均均为RNA提取专用，普通枪头及EP管需要用DEPC浸泡、消毒后使用。4、要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。试剂制备：75%乙醇（DEPC配制）：DEPC水：第二节 逆转录PCR【使用Fermentas ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit】1、取RNase-free的0.2微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中：试剂体积（l）总RNA（0.1-5ug）XOli

4、go(dT)18 primer （0.5 g/l）1.0RNA-free H2OYX+Y=11 l，温和混匀，65孵育5 min后迅速置于冰上。5 reaction buffer 4.010 mM dNTP Mix2.0RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor （20 U/l）1.0RevertAidTM M-MuLV ReverseTranscriptase （200 U/l）1.0 温和混匀，42 反应60 min，70 孵育10 min终止反应，冰上冷却。注意事项1、在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNAde完整性。2、实验中所有物品都应避免RNA酶的污染。

5、操作过程中均应戴手套。第三节 引物设计一、引物设计总体原则：1、配对引物区长度约20-24bp，GC含量比40-60%，尽量无多个连续的核苷酸序列（大于4个）；2、引物的3端不能被封闭，3端无较长的自身发卡结构（大于2个）；3、引物总长度最好不要超过40bp，特殊引物除外；二、基因克隆引物的设计：1、引物设计使用Primer Premier 5.0软件(简称PP 5.0)进行；2、首先将克隆的基因序列拷贝至PP 5.0软件中，保证所克隆基因的起始密码子位于30bp之后（即31bp开始为ATG。），基因的末端保证在终止密码子之后依然有超过20bp的延伸序列；3、点击Enzyme选项进行酶切分析，

6、找到不能切割序列的酶（Non-cutters），从中选择较为常用的两个酶（如Hind3、EcoR1、Xho1、BamH1和Kpn1等）进行克隆，同时注意此酶必须在目的载体的多克隆序列内；4、点击“primer”进行引物设计，先设计正向引物，将“S/A”选钮点至“S”，将引物序列固定至所需要克隆的起始端，点击“edit primers”，减去数个碱基后点击“prime”进行引物分析，观察引物的Tm值（60-70）、GC比例（40-60%），尽量符合此条件；5、在5端加上酶切序列，在酶切序列和配对序列之间斟情加减碱基以防止错码，在酶切序列之前添加3个保护碱基，保护碱基的序列可参考“NEB限制性内切

7、酶保护碱基表”或以个人习惯而定，最后将序列拷贝出；6、反向引物设计时，先将“S/A”点至“A”，同理进行设计，注意反向引物如果后续有标签序列，不能将终止密码子设计入引物中；三、普通PCR引物设计：普通PCR引物长度在18-22bp之间，引物需要跨内含子（即不同引物需要在不同的外显子之上），GC比例在40-60%之间，利用PP5.0分析上下游引物的退火温度在55-60左右，所PCR产物长度在100-250bp之间。第四节 目的基因基因克隆及PCR一、 实验原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:

8、(1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。二、 主要成分1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dN

9、TP应用NaOH 将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L。理论上4 种 dNTP各20mol/L，足以在100l反应中合成2.6g的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。3Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+

10、 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5 130min，95 40min，97 5min。6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L TrisCl (

11、20下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。TrisCl在20时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。三、 操作步骤1. 在冰浴中，将以下各成分加入一无菌0.2ml离心管中。10Pfu Buffer5ul10LA Buffer5uldNTP(2mM)4uldNTP(2

12、mM)10ul模板1ul模板1ul上游引物1ul上游引物1ul下游引物1ul下游引物1ulPfu酶0.5ulPfu酶0.5ulddH2O37.5ulddH2O31.5ul总体积50ul总体积50ul2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93 预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93 30s58 30s72 30s，循环30次，最后在72保温7min。3. 结束反应，PCR产物放置于4待电泳检测或-20长期保存。4. PCR的电泳检测：取PCR产物加6上样缓冲液，电泳检测。四、 注意事项1. PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。2. 吸头

13、、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。3. 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。4. 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。5.如果使用质粒或纯化好的DNA片段当模板，模板量应在10-50ng内。第五节 胶回收1、使用TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。3、称量胶块重量，切碎胶块，按1mg：1ul的比例加入Binding Buffer4、均匀混合后，60加热直至胶块融化，此时应间断振荡混合，可使胶块充分融化5、

14、胶融化后，待恢复至室温，将胶块融化液加入到Column中，静置2-3min，12000rpm离心1min6、将Collection Tube中的胶块融化液倒入Column中， 12000rpm 1min再离心一次，以提高回收率7、弃滤液，加入650ulWashing Buffer，12000rpm离心1min 8、弃滤液，再加入650ulWashing Buffer，12000rpm离心1min 9、弃滤液，12000rpm开盖空离2min，Column放置于新的1.5ml的离心管上，在Column膜中央处加入30-50ul的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置3min。（注：把

15、灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60使用时有利于提高洗脱效率）10、12000rpm离心1min第六节 酶切限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。1.将以下各成分加入一无菌0.2ml离心管中。内切酶Buffer3ul内切酶Buffer2ul内切酶I1ul内切酶I1ul内切酶II1ul内切酶II1ul待切DNA片段2ug待切质粒2ugddH2O加水至30ulddH2O加水至20ul总体积30ul总体积20ul2. 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），置于37 酶切1h以

16、上，使酶切反应完全，80 5min使酶失活。3.电泳检测第七节 连接及转化1、取新的经灭菌处理的0.2ml eppendorf管, 编号。2、将10-100ng酶切后回收的载体DNA转移到无菌离心管中，加3-10倍摩尔量的外源DNA片段。3、加入10T4 DNA ligase buffer 1l, T4 DNA ligase 0.5l, 加蒸馏水至体积为10l,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于室温（20-25）孵育2小时。4、取分装好的100ul感受态菌，置于冰上，待化开后无菌操作加入10ul连接产物，轻柔混匀，冰浴30min5、42热激90s，紧接着继续冰浴3min，无菌条件下加入3

17、00ul LB液体培养基，混匀，置于37摇床45min6、4000rpm，2min离心菌体，弃去上清液200l，将菌体沉淀吹打重悬并用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。倒置平板于37继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。7、用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp 50g/ml的 5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时。注意事项1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、连接反应后，反应液在0储存数天，-80储存2个月，但是在-20冰冻保存将

18、会降低转化效率。 第八节 感受态的制备1、从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中2、37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD600 0.5左右。 (注：以下操作均应在冰浴中进行。)3、将培养液50ml分装入50ml离心管中。4离心，4000rpm 10min，弃去上清。4、用冰浴的0.1M MgCl2 20ml 悬浮30min5、4离心，4000rpm 10min，弃上清，加入冰浴的0.1M CaCl2甘油1ml悬浮，按100ul/管分装

19、到1.5ml离心管中。6、-70保存质粒抽提1、 用1.5ml离心管收集1-5ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清2、 加入250ul溶液I/RNase A混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。室温静置1-2min。（初次使用试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液I中，均匀混合后于4保存）3、 加入250ul溶液II，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温静置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。（注：若溶液II出现沉淀，清于37保温溶解，待恢复至室温后使用；不可剧烈混合，否则会使染色体DNA断裂；此步骤不宜超过5min）4、 加入350ul溶液III，立即轻柔地反

20、复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。5、 12000rpm室温离心10min，收集上清。6、 将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。（如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积800ul，可将上清分次加入DNA纯化柱中）7、 加入500ul溶液Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液8、 加入500ul溶液Washing Buffer，12000rpm离心1min，弃滤液9、 12000rpm离心3min，以彻底除去纯化柱中残留的液体10、将纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央膜处，悬空滴加30-100ulElution Buffer，室温放置2min，

21、-20保存第二章 蛋白质实验第一章 Western blot一、蛋白的提取及样品的制备（一）组织蛋白的提取及样品制备：1、从-80取出组织，融化后每100mg组织加入1ml蛋白裂解液，用剪刀剪碎，放置冰上裂解10min；2、冰上匀浆器匀浆，冰浴静置30min后移置EP管中；3、4，14000g离心15min，取上清；4、测定蛋白浓度，调整分装后按照2上样缓冲液：蛋白裂解液：DTT=5:4:1加入，煮沸5-10min，4，取出立即插入冰中冷却，然后12000g离心10min，取上清保存于-80，临用时取出煮沸3min后上样。（二）细胞蛋白的提取及样品制备：1、细胞予0.01MPBS洗涤2次；2、

22、加入1mlPBS后，细胞刮轻轻刮取细胞，移至1.5ml离心管中，1000g*5min离心收集细胞；3、加入配置好的蛋白裂解液加入细胞沉淀中，冰上裂解10min；4、12000g，5min离心收集蛋白上清，测定蛋白浓度；5、调整分装后按照4上样缓冲液：蛋白裂解液：DTT=5:4:1加入；也可以配置2上样缓冲液，按照4上样缓冲液：蛋白裂解液：DTT=2.5:6.5:1加入；6、煮沸1015min，4，12000g，10min离心，取上清保存于-80，用时取出煮沸3min后上样。（三）分泌蛋白的提取及样品制备：直接收集分泌液，照2SDS loading buffer：细胞培养上清：DTT=5:4:1

23、加入后煮沸。二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）1、装好架子，检查是否漏水；按照配方配制分离胶（下层胶），在胶上面加入一层异丙醇或蒸馏水，使胶平整，室温聚合30min左右；2、洗去异丙醇（直到没有气味），配制浓缩胶，迅速搅拌后加入，加入时注意不要有气泡，室温聚合20min；3、上样，电泳：上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V或者130V电压；对小分子量的蛋白检测（=胶=膜；2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路；3）膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。四、封闭：封闭缓冲液4C封闭过夜或者室温放入摇

24、床2小时。五、抗体孵育1、将稀释好的抗体和膜一起孵育，一般采用4C过夜或者室温2-3小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间；（抗体一般用牛奶稀释，注意封膜时不要有气泡，否则气泡处的膜与抗体接触不完全）2、TBST洗5 min3-5次；3、二抗孵育，室温2 h；4、TBST洗5 min3-5次。六、显影1、ECL显影，冲洗胶片；2、Oderssay扫膜，并保存。七、试验中所用到的试剂和缓冲溶液30% 丙烯酰胺 丙烯酰胺 29.2g 双丙烯酰胺 0.8g dH2O 定容至100ml2分离胶缓冲液 Tris base 9.075 g SDS 0.2g 调节pH=8.8 dH2O定容至100

25、ml 2储备胶缓冲液 Tris base 3.025g SDS 200mg 调节pH=6.8 dH2O定容至100ml 10%过硫酸铵 过硫酸铵 100mg dH2O 1ml4上样缓冲液 1M Tris-Cl（pH 6.8） 20ml 甘油 40ml SDS 8g 溴酚蓝 1g dH2O 定容至100ml2上样缓冲液 1M Tris-Cl（pH 6.8） 10ml 甘油 20ml 10%SDS 40ml 溴酚蓝 0.5g dH2O 定容至100ml10电泳缓冲液 Tris 30.2g 甘氨酸 188g SDS 10g dH2O 定容至1000ml （使用时10电泳缓冲液与dH2O以1:9稀释）

26、电泳缓冲液 Tris 3.02g 甘氨酸 18.8g 10%SDS 10ml dH2O 定容至1000ml10转膜缓冲液 Tris 3.03g 甘氨酸 14.4g dH2O 定容至1000ml（使用时10转膜缓冲液与甲醇及dH2O以1:2:7稀释）转膜缓冲液 Tris 3.03g 甘氨酸 14.4g 甲醇 200ml dH2O 定容至1000ml10TBST缓冲液 Tris 24.2g NaCl 80g dH2O 定容至1000 ml （使用时10TBST缓冲液与dH2O以1:9稀释，并加入0.5ml Tween 20）TBST缓冲液 Tris 2.42g NaCl 8g Tween 20 0

27、.5ml dH2O 定容至1000 ml5%封闭缓冲液 脱脂奶粉 5g TBST缓冲液 100ml考马斯亮蓝R-250染色液 考马斯亮蓝R-250 1g 异丙醇 250ml 乙酸 100ml dH2O 定容至1000ml考马斯亮蓝染色脱色液 乙酸 100ml 乙醇 50ml dH2O 400ml丽春红染色液 丽春红 0.5g 乙酸 1ml dH2O 定容至100ml分离胶配方（10ml） 6% 8% 10% 12% 15% H2O 2.9ml 2.2ml 1.6ml 0.9ml 0ml 30% 丙烯酰胺 2.0ml 2.7ml 3.3ml 4.0ml 5.0ml 2分离胶缓冲液 5.0ml 5

28、.0ml 5.0ml 5.0ml 5.0ml 10%过硫酸铵 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml TEMED 8 l 6 l 4 l 4 l 4 l浓缩胶配方（4ml） H2O 1.5ml 30% 丙烯酰胺 0.5ml 2分离胶缓冲液 2.0ml 10%过硫酸铵 0.04ml TEMED 4 l免疫组化一、切片准备：1、石蜡切片：组织切片在60 恒温箱中烘烤6-8 h，如果不是连续烤片，浸二甲苯前应在60 烤0.5-1 h。（1）脱蜡：组织切片置于二甲苯中浸泡15分钟,更换二甲苯后再浸泡15分钟（2）水化：分别过无水乙醇95%乙醇80%乙醇70%乙醇自来水ddH2O冰冻切片：将切片放在37 烘烤1 h，然后置于组化PBS中浸泡，易脱片，一般不用高温修复2、 抗原热修复 a 高压热修复 先将高压锅中水煮沸，在瓷缸中加入0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0），将玻片置于金属染色架上放入瓷缸内后置于高压锅中，盖上不锈钢锅盖，缓慢加压，待小阀门升起来后，继续加热3分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01 M的枸橼酸钠缓冲液（pH 6