实验步骤方法教材.docx
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实验步骤方法教材
第一章DNA及RNA实验
第一节组织和细胞RNA的制备
1、样品处理：
（1）培养细胞：
悬浮细胞：
收获细胞2-4×106，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。
（2）贴壁细胞：
将细胞弃去培养基，用冰浴的PBS洗涤一次，之后在培养皿中加入Trizol（以一个80-90%融合度的6cm培养皿加入1ml的Trizol为准），用枪吹打贴壁的细胞，待细胞完全吹打下来，转入1.5ml离心管中。
（3）组织：
取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置5min。
2、加入0.2ml氯仿，震荡15s，静置2min，4℃离心，12000rpm×15min，取上清。
3、加入0.5ml异丙醇（或与上清等体积），将管中液体轻轻混匀，静置10min，4℃离心，12000rpm×10min，弃上清。
4、加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。
4℃，7500rpm×5min，弃上清。
5、重复用乙醇洗涤一次。
6、在室温中放置10min晾干，20-30ul加入适量的DEPC水溶解（65℃促溶10-15min）
注意事项：
1、细胞量和Trizol的加入量一定要按步骤1的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会是内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2、在细胞加入Trizol裂解后，如近期不需要使用RNA，可将Trizol裂解的细胞暂存于-80℃中。
3、实验过程必须严格防止RNase的污染。
提取RNA所使用的镊子、饭盒等需要经过高温烘烤后才可使用；RNA提取所使用的枪头、EP管均均为RNA提取专用，普通枪头及EP管需要用DEPC浸泡、消毒后使用。
4、要避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。
试剂制备：
75%乙醇（DEPC配制）：
DEPC水：
第二节逆转录PCR
【使用FermentasReverAidFirstStrandcDNASynthesisKit】
1、取RNase-free的0.2微量离心管，冰上依次加入下列试剂的混合物至管中：
试剂
体积（l）
总RNA（0.1-5ug）
X
Oligo（dT）18primer（0.5g/l）
1.0
RNA-freeH2O
Y
X+Y=11l，温和混匀，65℃孵育5min后迅速置于冰上。
5×reactionbuffer
4.0
10mMdNTPMix
2.0
RiboLockTMRibonucleaseInhibitor（20U/l）
1.0
RevertAidTMM-MuLVReverseTranscriptase（200U/l）
1.0
温和混匀，42℃反应60min，70℃孵育10min终止反应，冰上冷却。
注意事项
1、在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNAde完整性。
2、实验中所有物品都应避免RNA酶的污染。
操作过程中均应戴手套。
第三节引物设计
一、引物设计总体原则：
1、配对引物区长度约20-24bp，GC含量比40-60%，尽量无多个连续的核苷酸序列（大于4个）；
2、引物的3’端不能被封闭，3’端无较长的自身发卡结构（大于2个）；
3、引物总长度最好不要超过40bp，特殊引物除外；
二、基因克隆引物的设计：
1、引物设计使用PrimerPremier5.0软件（简称PP5.0）进行；
2、首先将克隆的基因序列拷贝至PP5.0软件中，保证所克隆基因的起始密码子位于30bp之后（即31bp开始为ATG。
。
。
），基因的末端保证在终止密码子之后依然有超过20bp的延伸序列；
3、点击Enzyme选项进行酶切分析，找到不能切割序列的酶（Non-cutters），从中选择较为常用的两个酶（如Hind3、EcoR1、Xho1、BamH1和Kpn1等）进行克隆，同时注意此酶必须在目的载体的多克隆序列内；
4、点击“primer”进行引物设计，先设计正向引物，将“S/A”选钮点至“S”，将引物序列固定至所需要克隆的起始端，点击“editprimers”，减去数个碱基后点击“prime”进行引物分析，观察引物的Tm值（60-70℃）、GC比例（40-60%），尽量符合此条件；
5、在5’端加上酶切序列，在酶切序列和配对序列之间斟情加减碱基以防止错码，在酶切序列之前添加3个保护碱基，保护碱基的序列可参考“NEB限制性内切酶保护碱基表”或以个人习惯而定，最后将序列拷贝出；
6、反向引物设计时，先将“S/A”点至“A”，同理进行设计，注意反向引物如果后续有标签序列，不能将终止密码子设计入引物中；
三、普通PCR引物设计：
普通PCR引物长度在18-22bp之间，引物需要跨内含子（即不同引物需要在不同的外显子之上），GC比例在40-60%之间，利用PP5.0分析上下游引物的退火温度在55-60℃左右，所PCR产物长度在100-250bp之间。
第四节目的基因基因克隆及PCR
一、实验原理
PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:
（1）变性（Denature）:
目的双链DNA片段在94℃下解链;
（2）退火（Anneal）:
两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对;（3）延伸（Extension）:
在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
二、主要成分
1.引物：
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
2.4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：
dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。
dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。
理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。
当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。
3．Mg2+：
Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。
对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。
4.模板：
PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）.就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。
5.TaqDNA聚合酶：
一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min，95℃40min，97℃5min。
6.反应缓冲液：
反应缓冲液一般含10-50mmol/LTris·Cl（20℃下pH8.3-8.8），50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+。
Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火。
另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA）,它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
三、操作步骤
1.在冰浴中，将以下各成分加入一无菌0.2ml离心管中。
10×PfuBuffer
5ul
10×LABuffer
5ul
dNTP（2mM）
4ul
dNTP（2mM）
10ul
模板
1ul
模板
1ul
上游引物
1ul
上游引物
1ul
下游引物
1ul
下游引物
1ul
Pfu酶
0.5ul
Pfu酶
0.5ul
ddH2O
37.5ul
ddH2O
31.5ul
总体积
50ul
总体积
50ul
2.调整好反应程序。
将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。
一般：
在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：
93℃30s→58℃30s→72℃30s，循环30次，最后在72℃保温7min。
3.结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测：
取PCR产物加6×上样缓冲液，电泳检测。
四、注意事项
1.PCR非常灵敏,操作应尽可能在无菌操作台中进行。
2.吸头、离心管应高压灭菌,每次吸头用毕应更换,不要互相污染试剂。
3.加试剂前,应短促离心10秒钟,然后再打开管盖,以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
4.应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
5.如果使用质粒或纯化好的DNA片段当模板，模板量应在10-50ng内。
第五节胶回收
1、使用TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
2、在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
3、称量胶块重量，切碎胶块，按1mg：
1ul的比例加入BindingBuffer
4、均匀混合后，60℃加热直至胶块融化，此时应间断振荡混合，可使胶块充分融化
5、胶融化后，待恢复至室温，将胶块融化液加入到Column中，静置2-3min，12000rpm离心1min
6、将CollectionTube中的胶块融化液倒入Column中，12000rpm1min再离心一次，以提高回收率
7、弃滤液，加入650ulWashingBuffer，12000rpm离心1min
8、弃滤液，再加入650ulWashingBuffer，12000rpm离心1min
9、弃滤液，12000rpm开盖空离2min，Column放置于新的1.5ml的离心管上，在Column膜中央处加入30-50ul的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置3min。
（注：
把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率）
10、12000rpm离心1min
第六节酶切
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
1.将以下各成分加入一无菌0.2ml离心管中。
内切酶Buffer
3ul
内切酶Buffer
2ul
内切酶I
1ul
内切酶I
1ul
内切酶II
1ul
内切酶II
1ul
待切DNA片段
2ug
待切质粒
2ug
ddH2O
加水至30ul
ddH2O
加水至20ul
总体积
30ul
总体积
20ul
2.混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），置于37℃酶切1h以上，使酶切反应完全，80℃5min使酶失活。
3.电泳检测
第七节连接及转化
1、取新的经灭菌处理的0.2mleppendorf管,编号。
2、将10-100ng酶切后回收的载体DNA转移到无菌离心管中，加3-10倍摩尔量的外源DNA片段。
3、加入10×T4DNAligasebuffer1μl,T4DNAligase0.5μl,加蒸馏水至体积为10μl,混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于室温（20-25℃）孵育2小时。
4、取分装好的100ul感受态菌，置于冰上，待化开后无菌操作加入10ul连接产物，轻柔混匀，冰浴30min
5、42℃热激90s，紧接着继续冰浴3min，无菌条件下加入300ulLB液体培养基，混匀，置于37℃摇床45min
6、4000rpm，2min离心菌体，弃去上清液200μl，将菌体沉淀吹打重悬并用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37℃下培养半小时以上，直至液体被完全吸收。
倒置平板于37℃继续培养12-16小时，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
7、用无菌枪头挑取白色单菌落接种于含Amp50μg/ml的5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时。
注意事项
1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。
2、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
第八节感受态的制备
1、从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中
2、37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:
100-1:
50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。
（注：
以下操作均应在冰浴中进行。
）
3、将培养液50ml分装入50ml离心管中。
4℃离心，4000rpm10min，弃去上清。
4、用冰浴的0.1MMgCl220ml悬浮30min
5、4℃离心，4000rpm10min，弃上清，加入冰浴的0.1MCaCl2－甘油1ml悬浮，按100ul/管分装到1.5ml离心管中。
6、-70℃保存
质粒抽提
1、用1.5ml离心管收集1-5ml菌液，12000rpm离心1min，弃上清
2、加入250ul溶液I/RNaseA混合液，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。
室温静置1-2min。
（初次使用试剂盒时，请将RNaseA全部加入到溶液I中，均匀混合后于4℃保存）
3、加入250ul溶液II，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
室温静置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
（注：
若溶液II出现沉淀，清于37℃保温溶解，待恢复至室温后使用；不可剧烈混合，否则会使染色体DNA断裂；此步骤不宜超过5min）
4、加入350ul溶液III，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。
此时会出现白色絮状沉淀。
5、12000rpm室温离心10min，收集上清。
6、将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。
（如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积800ul，可将上清分次加入DNA纯化柱中）
7、加入500ul溶液WashingBuffer，12000rpm离心1min，弃滤液
8、加入500ul溶液WashingBuffer，12000rpm离心1min，弃滤液
9、12000rpm离心3min，以彻底除去纯化柱中残留的液体
10、将ＤＮＡ纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央膜处，悬空滴加30-100ulElutionBuffer，室温放置2min，-20℃保存
第二章蛋白质实验
第一章Westernblot
一、蛋白的提取及样品的制备
（一）组织蛋白的提取及样品制备：
1、从-80℃取出组织，融化后每100mg组织加入1ml蛋白裂解液，用剪刀剪碎，放置冰上裂解10min；
2、冰上匀浆器匀浆，冰浴静置30min后移置EP管中；
3、4℃，14000g离心15min，取上清；
4、测定蛋白浓度，调整分装后按照2×上样缓冲液：
蛋白裂解液：
DTT=5:
4:
1加入，煮沸5-10min，4℃，取出立即插入冰中冷却，然后12000g离心10min，取上清保存于-80℃，临用时取出煮沸3min后上样。
（二）细胞蛋白的提取及样品制备：
1、细胞予0.01MPBS洗涤2次；
2、加入1mlPBS后，细胞刮轻轻刮取细胞，移至1.5ml离心管中，1000g*5min离心收集细胞；
3、加入配置好的蛋白裂解液加入细胞沉淀中，冰上裂解10min；
4、12000g，5min离心收集蛋白上清，测定蛋白浓度；
5、调整分装后按照4×上样缓冲液：
蛋白裂解液：
DTT=5:
4:
1加入；也可以配置2×上样缓冲液，按照4×上样缓冲液：
蛋白裂解液：
DTT=2.5:
6.5:
1加入；
6、煮沸10~15min，4℃，12000g，10min离心，取上清保存于-80℃，用时取出煮沸3min后上样。
（三）分泌蛋白的提取及样品制备：
直接收集分泌液，照2×SDSloadingbuffer：
细胞培养上清：
DTT=5:
4:
1加入后煮沸。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
1、装好架子，检查是否漏水；按照配方配制分离胶（下层胶），在胶上面加入一层异丙醇或蒸馏水，使胶平整，室温聚合30min左右；
2、洗去异丙醇（直到没有气味），配制浓缩胶，迅速搅拌后加入，加入时注意不要有气泡，室温聚合20min；
3、上样，电泳：
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V或者130V电压；对小分子量的蛋白检测（<100KDa）也可以采用120V电压，不需要换电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
三、转膜
1、电泳结束后，将胶剥出，切除上层胶和部分下层胶，置于转膜缓冲液中平衡15min；
2、准备PVDF膜，在甲醇中透明1min，dH2O中洗去甲醇，膜停止转动后放置于转膜缓冲液中平衡15min；
3、切取与胶-膜大小相似的滤纸，置于转膜缓冲液中平衡15min；
4、准备冰盒，将转膜槽放入其中；
5、从正极到负极（黑→白）依次放好海绵垫、滤纸、胶条、PVDF膜、滤纸和海绵垫（注意胶和膜间不要有气泡）；
6、装好电转移仪，300mA转移2h，板中出现由下向上溢出的气泡后向冰盒中加入冰块。
【注意】1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=胶>=膜；2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路；3）膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。
而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。
四、封闭：
封闭缓冲液4°C封闭过夜或者室温放入摇床2小时。
五、抗体孵育
1、将稀释好的抗体和膜一起孵育，一般采用4°C过夜或者室温2-3小时，可根据抗体量和膜上抗原量适当延长或缩短时间；（抗体一般用牛奶稀释，注意封膜时不要有气泡，否则气泡处的膜与抗体接触不完全）
2、TBST洗5min×3-5次；
3、二抗孵育，室温2h；
4、TBST洗5min×3-5次。
六、显影
1、ECL显影，冲洗胶片；
2、Oderssay扫膜，并保存。
七、试验中所用到的试剂和缓冲溶液
30%丙烯酰胺
丙烯酰胺29.2g
双丙烯酰胺0.8g
dH2O定容至100ml
2×分离胶缓冲液
Trisbase9.075g
SDS0.2g
调节pH=8.8dH2O定容至100ml
2×储备胶缓冲液
Trisbase3.025g
SDS200mg
调节pH=6.8dH2O定容至100ml
10%过硫酸铵
过硫酸铵100mg
dH2O1ml
4×上样缓冲液
1MTris-Cl（pH6.8）20ml
甘油40ml
SDS8g
溴酚蓝1g
dH2O定容至100ml
2×上样缓冲液
1MTris-Cl（pH6.8）10ml
甘油20ml
10%SDS40ml
溴酚蓝0.5g
dH2O定容至100ml
10×电泳缓冲液
Tris30.2g
甘氨酸188g
SDS10g
dH2O定容至1000ml
（使用时10×电泳缓冲液与dH2O以1:
9稀释）
电泳缓冲液
Tris3.02g
甘氨酸18.8g
10%SDS10ml
dH2O定容至1000ml
10×转膜缓冲液
Tris3.03g
甘氨酸14.4g
dH2O定容至1000ml
（使用时10×转膜缓冲液与甲醇及dH2O以1:
2:
7稀释）
转膜缓冲液
Tris3.03g
甘氨酸14.4g
甲醇200ml
dH2O定容至1000ml
10×TBST缓冲液
Tris24.2g
NaCl80g
dH2O定容至1000ml
（使用时10×TBST缓冲液与dH2O以1:
9稀释，并加入0.5mlTween20）
TBST缓冲液
Tris2.42g
NaCl8g
Tween200.5ml
dH2O定容至1000ml
5%封闭缓冲液
脱脂奶粉5g
TBST缓冲液100ml
考马斯亮蓝R-250染色液
考马斯亮蓝R-2501g
异丙醇250ml
乙酸100ml
dH2O定容至1000ml
考马斯亮蓝染色脱色液
乙酸100ml
乙醇50ml
dH2O400ml
丽春红染色液
丽春红0.5g
乙酸1ml
dH2O定容至100ml
分离胶配方（10ml）
6%8%10%12%15%
H2O2.9ml2.2ml1.6ml0.9ml0ml
30%丙烯酰胺2.0ml2.7ml3.3ml4.0ml5.0ml
2×分离胶缓冲液5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml
10%过硫酸铵0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml
TEMED8l6l4l4l4l
浓缩胶配方（4ml）
H2O1.5ml
30%丙烯酰胺0.5ml
2×分离胶缓冲液2.0ml
10%过硫酸铵0.04ml
TEMED4l
免疫组化
一、切片准备：
1、石蜡切片：
组织切片在60℃恒温箱中烘烤6-8h，如果不是连续烤片，浸二甲苯前应在60℃烤0.5-1h。
（1）脱蜡：
组织切片置于二甲苯中浸泡15分钟,更换二甲苯后再浸泡15分钟
（2）水化：
分别过无水乙醇→95%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→自来水→ddH2O
冰冻切片：
将切片放在37℃烘烤1h，然后置于组化PBS中浸泡，易脱片，一般不用高温修复
2、抗原热修复
a高压热修复先将高压锅中水煮沸，在瓷缸中加入0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0），将玻片置于金属染色架上放入瓷缸内后置于高压锅中，盖上不锈钢锅盖，缓慢加压，待小阀门升起来后，继续加热3分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b沸热修复电炉或水浴锅加热0.01M的枸橼酸钠缓冲液（pH6
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