浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究.docx

1、浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究【摘要】 目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体，并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3105/mL时，超声破碎，纯化获得EB病毒膜蛋白抗原；EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化，在家兔背部皮下多点免疫注射，间隔2周免疫，共3次，并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，检测兔免疫血清抗体IgG；进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性，同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果 ：所有家兔在全程免疫后都产生了高效价

2、膜蛋白的特异性抗体，最高滴度达1:6 400。结论 ：用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔，可成功制备高效价的特异性血清抗体，为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。【关键词】 EBV；抗体；免疫性 Abstract: Objective: To prepare high-titer rabbit serum antibody against EBV membrane protein. Methods: B95-8(EBV) cells were cultivated and proliferated in cell culture system with RPMI-1640

3、culture medium (with 10% FBS and Pen/Strep). Thereafter，the purified B95-8(EBV) was harvested using supercentrifuge method. Prepare EBV membrane protein containing Freund adjuvant by routine method. Four rabbits were immunized with the prepared antigen by subcutaneous injection at various sites of s

4、kin on back for every two weeks，three times in all. The sera of these immunized rabbits were collected separately for preparation of the rabbit serum IgG. Specific binding of the rabbit serum antibody and the EBV membrane protein were analyzed by Western blot and the titer was assayed by ELISA. Resu

5、lts: All of the immunized rabbits produced high-titer serum antibody after the second booster. The highest titer of antibody against EBV membrane protein was 1:6 400. The result of Western blot showed the rabbit serum antibody could bind to the EBV membrane protein specifically. Conclusion: The spec

6、ific rabbit serum antibody against EBV membrane antigen，with high titer，is successfully prepared. It laid a foundation of development of immunology method for detection of EBV membrane antigen. Key words: EBV；antibody；immunity EB病毒是一含有包膜的DNA病毒，在人群中感染非常普遍，与某些肿瘤的发生和发展密切相关1，如Burkitts淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和成人T细胞淋

7、巴瘤等，其中鼻咽癌在东南亚及我国南方地区高发；研究发现，EBV感染尚与胃癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤的发病有一定的相关性2-3。EBV在感染机体时，可在宿主细胞膜上表达包膜糖蛋白及潜伏膜蛋白等膜蛋白，可诱导机体产生特异性的免疫反应。因此，EBV膜蛋白是EBV病毒检测及其疫苗制备研究的靶抗原，是目前EBV研究的前沿热点之一。为获得高效价的EBV膜蛋白抗体，本研究利用B95-8细胞制备EBV膜抗原，通过免疫家兔制备特异性免疫血清，并对其效价和与EBV结合的特异性进行了鉴定。 1 材料和方法 材料细胞：B95-8为EB病毒转化的绒猴白细胞，购自上海中科院细胞库。家兔：选择健康日本大耳白兔，雌性，体重 kg

8、,由温州医学院实验动物中心提供，动物批号：SCXK(浙)2005-0021。试剂：胎牛血清为Gibco公司产品，细胞培养基RPMI-1640为Hyclone产品，完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂购自晶美公司，山羊抗兔IgG(H+L)-HRP购自杭州联科生物公司，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于天根试剂公司，OPD底物购于北京拜尔迪公司，预染蛋白分子量标准为ferments 公司产品，其他试剂均为国产分析纯产品。方法B95-8 细胞的培养：采用含10%胎牛血清及青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基，37 ，5% CO2条件下常规培养B95-8细胞。每天显微镜下观察细胞生长情况，并计数。EB

9、病毒膜蛋白抗原的制备: 制备方法参见文献5-6，即将3105/mL B95-8细胞培养10 d，经10 000g离心20 min收集细胞沉淀，PBS洗涤2次，将细胞调整到2108/mL，经超声破碎的细胞即为制备的EBV膜蛋白。将其置于60 水浴中，30 min灭活后进行家兔免疫。家兔免疫：选择4只纯种健康日本大耳白家兔，分别用制备的EB病毒膜蛋白抗原进行免疫。实验前采集家兔血清，作为阴性对照；按照0周、2周、4周免疫程序进行免疫，抗原与完全弗氏佐剂等量混合，充分乳化，每次每只家兔背部皮下多点注射3 mLEB病毒膜蛋白抗原。同时，于1周、3周自兔耳缘静脉取血，第3次免疫后1周，兔心脏取血。收集的

10、血液于4 下静置过夜，3 000g离心5 min，取血清分装，置于-20 下保存备用。血清抗体效价的检测：参见文献用间接ELISA法进行血清效价检测，即将纯化的EB病毒膜蛋白抗原稀释后包被于ELISA板，置于4 下过夜，经洗涤、封闭后加入不同稀释度的免疫兔血清，二抗为HRP-标记的山羊抗兔IgG(H+L)。反应结果置Bio Elx 800酶标仪于490 nm处读取吸光度A值，所有血清标本均重复3孔检测，并设免疫前血清作为阴性对照，同时以生理盐水作为空白对照。血清抗体的特异性检测：采用Western blot 方法对制备的血清抗体与EBV膜蛋白抗原结合的特异性进行检测。经SDS-PAGE电泳分离

11、后，再转印蛋白至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉-TBST于4 封闭过夜，漂洗3次后加入不同稀释度的免疫兔血清，37 震荡孵育1 h，漂洗3次后加入1:5000 稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)，再于37 震荡孵育1 h，漂洗3次后DAB显色。 2 结果 B95-8细胞培养 B95-8细胞为悬浮细胞，镜下观察细胞数目多，形成多个细胞岛，形态规则，折光性好，表明生长状态良好，见图1。EB病毒膜蛋白血清抗体效价检测结果 4只家兔免疫血清经1:50直至1:6 400稀释度倍比稀释，各稀释度血清于490 nm波长处读取吸光度值，见表1。按照公式：待测标本A值-空白对照A值/(阴性对照A值-空白对

12、照A值)为阳性，阳性血清的最高稀释度即为该血清的效价。结果，4只家兔在全程免疫后均产生了血清特异性抗体。EB病毒膜蛋白血清抗体产生趋势分析结果 4只家兔血清特异性抗体在0、1、3、5周产生趋势，见图2。于免疫后约1周，4 只家兔均开始产生血清特异性抗体，并于第5周达到最大值。4只家兔之间血清特异性抗体效价比较差异无显着性。EBV血清抗体特异性检测结果 兔免疫血清分别按1:50、1:100 和1:200稀释后，用Western Blot检测其与EBV膜蛋白结合的特异性。结果如图3示，血清稀释到1:100时硝酸纤维膜上出现清晰的3条特异性条带，分子质量大小分别约为54 kD、39 kD和18 kD

13、。而培养基对照孔则无。 3 讨论 目前，制备抗体常用的方法有免疫动物或杂交瘤细胞技术等。利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具备纯度高、特异性强等优点，在临床诊断、治疗和实验研究中应用广泛，但是单克隆抗体仍然存在仅针对单个抗原表位的局限性，同时制备技术要求高，成本昂贵。而利用免疫动物制备的免疫血清多克隆抗体具有制备简单、成本低、来源方便等优点，且可同时针对多个抗原表位从而提高检测的敏感性，因此在免疫学检测和诊断实验技术中仍然应用广泛。 Tsuge等从传染性单核细胞增多症患者体内分离的B细胞中提取EBV，进而感染非洲绒猴B淋巴细胞，建立了EBV转化的细胞系，即B95-8细胞。B95-8细胞为一悬浮细胞

14、，其培养上清中含有释放出的EB病毒完整颗粒，而细胞膜上却表达各种EB病毒的蛋白，包括包膜糖蛋白和仅在潜伏感染时表达的LMP。LMP有LMP1和LMP2两种类型，前者是目前唯一被证实能促进细胞转化甚至恶变的重要物质，其引起的免疫反应较弱；后者本身不是转化蛋白，但在EB病毒感染的患者体内可持续表达，并可诱导机体产生有效的保护性免疫应答。因此，LMP2成为EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原，用于EB病毒感染相关疾病的免疫机制、疫苗设计及其免疫效应等研究。 根据B95-8细胞的特点，各家实验室均有报道利用其制备EBV及EBV膜蛋白进行研究。Dolken等10用B95-8细胞制备的蛋白，通过固相放射免疫测定

15、法，证实用B95-8细胞可成功制备EBV膜蛋白，并且其膜蛋白复合物至少存在两个亚型。Sairenji等11用B95-8制备了EBV膜蛋白，发现可被EB病毒糖蛋白包膜抗原gp350/220的3种单克隆抗体所识别。本研究经Western blot检测，发现用B95-8细胞制备的EBV膜蛋白可出现3条特异性条带，其中分子量约54 kD和39 kD的条带分别与已知的LMP2A和LMP2B的分子量相一致。 采用B95-8细胞作为EB病毒膜蛋白抗原，通过免疫家兔制备EBV病毒膜蛋白免疫血清，经PubMed检索未见有类似的报道。本研究获得的EBV膜蛋白兔免疫血清，可进一步应用于EBV感染及其相关肿瘤性疾病的

16、检测，如可通过免疫荧光或免疫组化等方法检测组织细胞表达的EBV膜蛋白抗原，可进行定位诊断EBV感染等，为EBV感染的免疫机制研究及临床EB病毒感染的检测打下了基础。【参考文献】 1 Sample J, Liebowitz D, Kieff E. Two related Epstein-Barr virus membrane proteins are encoded by separate genes J. JVirol, 1989, 63(2):933-937. Bonnet M, Guinebretiere JM, Kremmer E,et al. Detection of Epstein-

17、Barr virus in invasive breast cancers J. J NatlCancer Inst, 1999, 91(16):1376-1381. Tao Q, Young LS, Woodman CB,et al. Epstein-Barr virus (EBV) and its associated human cancers-genetics, epigenetics,pathobiology and novel therapeutics J. Front Biosci, 2006,11(2):2672-2713. Lin JC, Raab-Traub N. Two

18、strains of Epstein-Barr virus (B95- 8 and a P3HR-1 subclone) that lack defective genomes induceearly antigen and cause abortive infection of Raji cells J. JVirol, 1987, 61(6):1985-1991. Fox RI, Pearson G, Vaughan JH. Detection of Epstein-Barr virus-associated antigens and DNA in salivary gland biops

19、iesfrom patients with Sjogrens syndrome J. J Immunol, 1986,137(10):3162-3168. Lennette ET, Ward E, Henle G,et al. Detection of antibod- ies to Epstein-Barr virus capsid antigen by immune adherencehemagglutination J. J Clin Microbiol, 1982, 15(1):69-73. 侯晓红, 朱珊丽, 王乐丹, 等. E血清型沙眼衣原体抗体的制 备及检测 J. 温州医学院学报

20、, 2007, 37(4): 344-346. Tsuge I, Morishima T, Kimura H,et al. Impaired cytotoxic T lymphocyte response to Epstein-Barr virus-infected NK cellsin patients with severe chronic active EBV infection J. JMed Virol, 2001, 64(2):141-148. Khanna R, Burrows SR, Nicholls J, et al. Identification of cytotoxic

21、T cell epitopes within Epstein-Barr virus (EBV)oncogene latent membrane protein 1 (LMP1): evidence forHLA A2 supertype-restricted immune recognition of EBV-infected cells by LMP1-specific cytotoxic T lymphocytesJ. Eur J Immunol, 1998, 28(2):451-458.10 Dolken G, Klein G. A solid-phase radioimmunoassa

22、y forEpstein-Barr virus-associated membrane antigen preparedfrom B95-8 cell culture supernatants J. J Natl Cancer Inst,1977, 58(5):1239-1245.11 Sairenji T, Bertoni G, Medveczky MM,et al. Inhibition ofEpstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane anti-gen gp350/220 J. J Virol, 1988, 62(8):2614-2621.