浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究.docx

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浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

浅论EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

【摘要】目的：

制备高效价EB病毒膜蛋白抗体，并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。

方法：

将B95-8细胞培养至3×105/mL时，超声破碎，纯化获得EB病毒膜蛋白抗原；EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化，在家兔背部皮下多点免疫注射，间隔2周免疫，共3次，并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清，检测兔免疫血清抗体IgG；进一步采用Westernblot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性，同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。

结果：

所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体，最高滴度达1:

6400。

结论：

用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔，可成功制备高效价的特异性血清抗体，为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。

【关键词】EBV；抗体；免疫性

Abstract:

Objective:

Topreparehigh-titerrabbitserumantibodyagainstEBVmembraneprotein.Methods:

B95-8（EBV）cellswerecultivatedandproliferatedincellculturesystemwithRPMI-1640culturemedium（with10%FBSandPen/Strep）.Thereafter，thepurifiedB95-8（EBV）washarvestedusingsupercentrifugemethod.PrepareEBVmembraneproteincontainingFreundadjuvantbyroutinemethod.Fourrabbitswereimmunizedwiththepreparedantigenbysubcutaneousinjectionatvarioussitesofskinonbackforeverytwoweeks，threetimesinall.TheseraoftheseimmunizedrabbitswerecollectedseparatelyforpreparationoftherabbitserumIgG.SpecificbindingoftherabbitserumantibodyandtheEBVmembraneproteinwereanalyzedbyWesternblotandthetiterwasassayedbyELISA.Results:

Alloftheimmunizedrabbitsproducedhigh-titerserumantibodyafterthesecondbooster.ThehighesttiterofantibodyagainstEBVmembraneproteinwas1:

6400.TheresultofWesternblotshowedtherabbitserumantibodycouldbindtotheEBVmembraneproteinspecifically.Conclusion:

ThespecificrabbitserumantibodyagainstEBVmembraneantigen，withhightiter，issuccessfullyprepared.ItlaidafoundationofdevelopmentofimmunologymethodfordetectionofEBVmembraneantigen.

Keywords:

EBV；antibody；immunity

EB病毒是一含有包膜的DNA病毒，在人群中感染非常普遍，与某些肿瘤的发生和发展密切相关[1]，如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、何杰金病和成人T细胞淋巴瘤等，其中鼻咽癌在东南亚及我国南方地区高发；研究发现，EBV感染尚与胃癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤的发病有一定的相关性[2-3]。

EBV在感染机体时，可在宿主细胞膜上表达包膜糖蛋白及潜伏膜蛋白等膜蛋白，可诱导机体产生特异性的免疫反应。

因此，EBV膜蛋白是EBV病毒检测及其疫苗制备研究的靶抗原，是目前EBV研究的前沿热点之一。

为获得高效价的EBV膜蛋白抗体，本研究利用B95-8细胞制备EBV膜抗原，通过免疫家兔制备特异性免疫血清，并对其效价和与EBV结合的特异性进行了鉴定。

1材料和方法

　材料

　细胞：

B95-8为EB病毒转化的绒猴白细胞，购自上海中科院细胞库。

　家兔：

选择健康日本大耳白兔，雌性，体重～kg,由温州医学院实验动物中心提供，动物批号：

SCXK（浙）2005-0021。

　试剂：

胎牛血清为Gibco公司产品，细胞培养基RPMI-1640为Hyclone产品，完全弗氏佐剂及不完全弗氏佐剂购自晶美公司，山羊抗兔IgG（H+L）-HRP购自杭州联科生物公司，增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购于天根试剂公司，OPD底物购于北京拜尔迪公司，预染蛋白分子量标准为ferments公司产品，其他试剂均为国产分析纯产品。

　方法

　B95-8细胞的培养：

采用含10%胎牛血清及青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2条件下常规培养B95-8细胞。

每天显微镜下观察细胞生长情况，并计数。

　EB病毒膜蛋白抗原的制备:

制备方法参见文献[5-6]，即将3×105/mLB95-8细胞培养10d，经10000×g离心20min收集细胞沉淀，PBS洗涤2次，将细胞调整到2×108/mL，经超声破碎的细胞即为制备的EBV膜蛋白。

将其置于60℃水浴中，30min灭活后进行家兔免疫。

　家兔免疫：

选择4只纯种健康日本大耳白家兔，分别用制备的EB病毒膜蛋白抗原进行免疫。

实验前采集家兔血清，作为阴性对照；按照0周、2周、4周免疫程序进行免疫，抗原与完全弗氏佐剂等量混合，充分乳化，每次每只家兔背部皮下多点注射3mLEB病毒膜蛋白抗原。

同时，于1周、3周自兔耳缘静脉取血，第3次免疫后1周，兔心脏取血。

收集的血液于4℃下静置过夜，3000×g离心5min，取血清分装，置于-20℃下保存备用。

　血清抗体效价的检测：

参见文献用间接ELISA法进行血清效价检测，即将纯化的EB病毒膜蛋白抗原稀释后包被于ELISA板，置于4℃下过夜，经洗涤、封闭后加入不同稀释度的免疫兔血清，二抗为HRP-标记的山羊抗兔IgG（H+L）。

反应结果置BioElx800酶标仪于490nm处读取吸光度A值，所有血清标本均重复3孔检测，并设免疫前血清作为阴性对照，同时以生理盐水作为空白对照。

　血清抗体的特异性检测：

采用Westernblot方法对制备的血清抗体与EBV膜蛋白抗原结合的特异性进行检测。

经SDS-PAGE电泳分离后，再转印蛋白至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉-TBST于4℃封闭过夜，漂洗3次后加入不同稀释度的免疫兔血清，37℃震荡孵育1h，漂洗3次后加入1:

5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L），再于37℃震荡孵育1h，漂洗3次后DAB显色。

2结果

　B95-8细胞培养B95-8细胞为悬浮细胞，镜下观察细胞数目多，形成多个细胞岛，形态规则，折光性好，表明生长状态良好，见图1。

　EB病毒膜蛋白血清抗体效价检测结果4只家兔免疫血清经1:

50直至1:

6400稀释度倍比稀释，各稀释度血清于490nm波长处读取吸光度值，见表1。

按照公式：

待测标本A值-空白对照A值/（阴性对照A值-空白对照A值）≥为阳性，阳性血清的最高稀释度即为该血清的效价。

结果，4只家兔在全程免疫后均产生了血清特异性抗体。

　EB病毒膜蛋白血清抗体产生趋势分析结果　4只家兔血清特异性抗体在0、1、3、5周产生趋势，见图2。

于免疫后约1周，4只家兔均开始产生血清特异性抗体，并于第5周达到最大值。

4只家兔之间血清特异性抗体效价比较差异无显着性。

　EBV血清抗体特异性检测结果兔免疫血清分别按1:

50、1:

100和1:

200稀释后，用WesternBlot检测其与EBV膜蛋白结合的特异性。

结果如图3示，血清稀释到1:

100时硝酸纤维膜上出现清晰的3条特异性条带，分子质量大小分别约为54kD、39kD和18kD。

而培养基对照孔则无。

3讨论

目前，制备抗体常用的方法有免疫动物或杂交瘤细胞技术等。

利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具备纯度高、特异性强等优点，在临床诊断、治疗和实验研究中应用广泛，但是单克隆抗体仍然存在仅针对单个抗原表位的局限性，同时制备技术要求高，成本昂贵。

而利用免疫动物制备的免疫血清多克隆抗体具有制备简单、成本低、来源方便等优点，且可同时针对多个抗原表位从而提高检测的敏感性，因此在免疫学检测和诊断实验技术中仍然应用广泛。

Tsuge等从传染性单核细胞增多症患者体内分离的B细胞中提取EBV，进而感染非洲绒猴B淋巴细胞，建立了EBV转化的细胞系，即B95-8细胞。

B95-8细胞为一悬浮细胞，其培养上清中含有释放出的EB病毒完整颗粒，而细胞膜上却表达各种EB病毒的蛋白，包括包膜糖蛋白和仅在潜伏感染时表达的LMP。

LMP有LMP1和LMP2两种类型，前者是目前唯一被证实能促进细胞转化甚至恶变的重要物质，其引起的免疫反应较弱；后者本身不是转化蛋白，但在EB病毒感染的患者体内可持续表达，并可诱导机体产生有效的保护性免疫应答。

因此，LMP2成为EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原，用于EB病毒感染相关疾病的免疫机制、疫苗设计及其免疫效应等研究。

根据B95-8细胞的特点，各家实验室均有报道利用其制备EBV及EBV膜蛋白进行研究。

Dolken等[10]用B95-8细胞制备的蛋白，通过固相放射免疫测定法，证实用B95-8细胞可成功制备EBV膜蛋白，并且其膜蛋白复合物至少存在两个亚型。

Sairenji等[11]用B95-8制备了EBV膜蛋白，发现可被EB病毒糖蛋白包膜抗原gp350/220的3种单克隆抗体所识别。

本研究经Westernblot检测，发现用B95-8细胞制备的EBV膜蛋白可出现3条特异性条带，其中分子量约54kD和39kD的条带分别与已知的LMP2A和LMP2B的分子量相一致。

　　采用B95-8细胞作为EB病毒膜蛋白抗原，通过免疫家兔制备EBV病毒膜蛋白免疫血清，经PubMed检索未见有类似的报道。

本研究获得的EBV膜蛋白兔免疫血清，可进一步应用于EBV感染及其相关肿瘤性疾病的检测，如可通过免疫荧光或免疫组化等方法检测组织细胞表达的EBV膜蛋白抗原，可进行定位诊断EBV感染等，为EBV感染的免疫机制研究及临床EB病毒感染的检测打下了基础。

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