抗氧化酶活性等测定方法.docx

1、抗氧化酶活性等测定方法叶绿体得提取一、试剂配置、PS提取液:每L水依次加入MES(9.20。05=、7g)、山梨糖醇(0。33182。260。16g)、aC(、1058.5=0、85g)、MgC(.00295=0、19g)、EDA(292、5.0=、84g)、KH2PO(000.0005=、g);使用时加入ASN(98。10、00=0、962g);2、悬浮液:将BS提取液中得MES换为238。0.05、15g得HES(238、3。05=11。915);、8%Pro:8ml原液+0ml水;40Perol:0l原液60ml水;实际配制:PBS提取液2000l(3个处理*2个品种个重复20ml次=1

2、80m),悬浮液100ml(个处理2个品种3个重复*1m3次5ml); 8Percol 0ml;40%Percl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3m3次=162l)二、提取步骤1、10g鲜样加20l提取S(50mMMES PH、1,含0、3M山梨糖醇,10mM Nal,2mMgC,META,.5 mMKH2P,2mMASAa,ASNa使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液20g in,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快

3、使其下降停止,整个离心持续大约23左右完成;4、沉淀用ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(mM HPS p 7。6,含、 mM山梨糖醇,mMNal,2mM Mgl2,2mM EDTA,0。5mMKH2P,2mMASA,AS-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素g、ml-1以上,这样有利于保持活性。6、000g 1min;7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用rcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80Pecl(原液按100算)

4、铺在0m离心管下层,再把l 40Perol铺在离心管中层,然后将1m叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)5002-3mn(用水平离心头得离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到),下降也要缓慢下降,否则会破碎Pero得浓度梯度层得形成,取出会瞧到层绿色带,最上层为破碎得叶绿体,沉在地层得为粗颗粒,4080得Pecol之间得界面有一层绿色层为完整得叶绿体;9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg.m1;(计算:取叶绿体悬浮液0.1m,加4.9 ml%得丙酮,摇匀后于00g离心2in,上清液置于m得比色杯,在25n上比色,按照公式计算:O65m/34.叶绿素g/m)10、测定叶绿体得完整

5、性,完整率达到-95%;参考:Taked K,OtauboT,Knda N. articipaion of hydogen erode i the inactiationf Cincycle SH nzyme ino2furmugad nac leaves。 Plantand cell Phsioogy,982,3:10091018。取上述制备得完整叶绿体进行如下测定:1、用0mMPBS(保护酶或其她测定项目得缓冲液)稀释25倍,用于测定SOD、PO、CAT、PX;2、用冷丙酮稀释2倍,取0。5M提取液用于测定H2;(本试验中用。2ml/L Cl稀释)3、用5得TCA稀释2-5倍,取1。5ml

6、用于测定MDA;4、用乙醇:丙酮:水=4。5:4。5:1稀释,用于测定叶绿素;抗氧化酶(S、D、CT、APX)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(OD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂得配制(1)0.5ml/磷酸缓冲液(BS,p7。8):A母液:0。2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4122O(分子量358.14)717g;母液:0.2ol磷酸二氢钠溶液:取Na2PO4H2O(分子量156.01)31.g。分别用蒸馏水定容到100ml。0、05mo/L BS(pH7、8)得配制:分别取A母液(NHO) 228。75m,B母液(a2PO4) 2.25ml,用蒸馏水定容至00l、参考文

7、献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术。高等教育出版社,200:2626。(2)14。5mM甲硫氨酸溶液:取2、637gMe用磷酸缓冲液(p7。)定容至00ml。()3MEDAa2溶液:取。001gDT-Na用磷酸缓冲液定容至100ml、(4)60核黄素溶液:取、03核黄素用磷酸缓冲液定容至100l,避光保存。 (5)。25M 氮蓝四唑(BT)溶液:取0。1840g NBT用S定容至100ml,避光保存。(上述试剂先配好,放到度冰箱,用之前临时按下面得方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上层,避免见光,第一组样品加好后拿出来加,加完后放回冰箱,第二组得样品加好后再拿出来加)酶液制备:取0。

8、g(可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷得研钵中,加入1。6m 50m/预冷得磷酸缓冲液(pH7、8)在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4、1000g下离心20min,上清液即为酶液。2、酶活性测定(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取Mt溶液2ml,DA2溶液0.m(加得量与前面得浓度要核对),磷酸缓冲液5、4ml,NBT溶液m,核黄素溶液6l,混合后摇匀;SD反应混合液:3个处理*个品种3次重复*3m次测定=162ml(实际配置0ml)(2)分别取3反应混合液与30l(可视情况调整,最好先做一个浓度梯度,瞧加多少合适,如果量太少,最好稀释后再加,这样精确)酶液于试管中

9、(尽可能加到试管得底部,要靠着试管壁打下去先加酶液,后加反应液,加好后摇一摇,瞧瞧试管上就是不就是有雾气,最好拿纱布把试管下边擦一下,免得雾气挡住光线照过去);(3)将试管置于光照培养箱中在40 lux光照下反应2min;(照光很重要,试管要选择相同规格得,因为不同得试管透光率就是不一样得,试管架不要选择遮光得,这个最好分组做,同时几组做相互之间会遮光,每一组一个重复,就就是每一组中都要有所有得处理,且都要有一个最大管,处理多得话,把根与叶分开做,最大管放在中间)同时做两支对照管,其中支试管取3m反应混合液加入0l PBS(不加酶液)照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用

10、于调零。(4)以不照光得对照管(只有缓冲液并置于暗处)调零后,避光测O5(出现颜色即可测定)。(5)酶活性计算:OD活性单位以抑制N光化还原50所需酶量(测得样品值要在最大管得一半左右才合适,否则要调整酶量)为1个酶活单位(u)。SO总活性 ( AckAE )V(/AkWVt)比活力=SOD总活性/蛋白质含量SO总活性以鲜重酶单位每克表示(u/g W);比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;Ack为照光对照管得吸光度;E为样品管得吸光度;为样品液总体积(ml,1、6ml,加入PBS得体积);Vt为测定时得酶液用量(ml,30ul);W为样品鲜重(g,测定时应换算为叶绿体得质量mg);蛋白质含量单位

11、为mg。二、P、CAT酶活性得测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶(OD)活性测定(愈创木酚法)(1)试剂配制:0、mo/L磷酸缓冲液(pH6、0):分别取A母液(NaH4 ) 12l与B母液(NaH2P4)877m混匀即为1000ml BS(0。,pH6、0);()反应混合液配制(以60个样为准):取20l PBS(0。2M,pH、0),加入0.076ml液体(原液)愈创木酚(甲氧基酚)加热搅拌溶解,冷却后加入0。12ml30得HO2,混匀后保存于冰箱中备用。PD反应混合液:3个处理2个品种3次重复33次测定=12ml(实际配置200l, 0.076ml, 0、112ml)(3)样品测定:

12、取3ml反应液并加入30酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值(测定0秒)。(边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢得话,要保证每个样品从加好样到开始记时得时间相差不大)(4)酶活性计算:以每n O值变化(升高)0、1为1个酶活性单位(u)、PO=(A70Vt)/(Vs0、01t) (u/g mi)A40:为反应时间内吸光度得变化;为样品鲜重();为反应时间(min);Vt为提取酶液总体积(ml,(1.ml);s为测定时取用酶液体积(ml,30ul)。2、过氧化氢酶(CAT)活性测定(1)试剂配制:0、5mL磷酸缓冲液(pH7。):取A母液(N2HPO4) 457、5 ml 与

13、B母液(NaH2PO) 29。l混合后用蒸馏水定容至1000ml、()反应液配制:取20ml S(、1M,p7.0),加入0、092l 30%得H2O(原液)摇匀即可。AT反应液:3个处理*个品种3次重复*3*3次测定=162(实际配置200 ml, 0、92ml)()样品测定:取3ml反应液加入0.1(可视情况调整)酶液,以PBS为对照调零,测定O40(紫外)(测定40s)。()酶活性计算:以每min 值减少0。1为1个酶活性单位(u)、T=A240t/(WV0。0) (u min)A240:为反应时间内吸光度得变化;W为样品鲜重(g);t为反应时间(i);为提取酶液总体积(ml, 1、6m

14、l);s为测定时取用酶液体积(m, 0。1l)。三、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性得测定(缓冲液为K)1、试剂配制(按个样计算): ()0。5m/L K2HP4-KH2PO4缓冲液(pH7。0)得配制:(A)K2HP4H:28。220、050.6=.96g(B)KH2PO: 136。090。0。39=2、658g,以上两者混合起来用去离子水定容到L、(2)、1 M EDTAa2:取0、0181gEDA-Na2用P溶液定容到50ml(372、2 g/M0.1m500ml=、161 g);(3)5 mM sA:取0。04抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml(现用现配,16.13g/M5M5ml=0

15、.04 g);()2mMH2O:取0.2l,30H2用去离子水稀释到10ml(3 H2O2为50g0/(34、0gM0、5)9、03M)、实际配置0、1 m DTA-Na2:3个处理2个品种*3次重复、ml3次测定=1、8l;(实际配置25ml,0。0305g) M得sA:个处理2个品种*次重复0。1ml3次测定=5。4;(实际配置50 ml,0。044g) 0mM 22: 3个处理*2个品种3次重复*0、1l*3次测定=5。4ml;(实际配置50,0。1ml)、酶活性得测定(以2 ml体系测定)(1)取0、10 ml 酶液(可视情况调整),加入。0 ml含0。mM TANa2得PBS(、05

16、 ml,p。),再加入0。1ml 5mM得sA,最后加入、0 ml 2m H2O2,立即在20下测定9(紫外)值在40s内(测定时间内变化大可测定得时间短点,否则长点)得变化,计算单位时间内AsA减少量与酶活性(室温下测定,缓冲液调零)。计算公式: OD/tVVT AWOD为反应时间内吸光度得变化(40秒吸光度0秒吸光度);t为反应时间(40秒);为反应液体积(2mL);VT提取液体积(。6L);A为消光系数(、8M-1.m-1);d为比色杯厚度(1m);Vt测定液体积(0。1mL);W为样品鲜重(0。2g)。四、超氧阴离子自由基(O2。-)产生速率得测定(羟胺氧化法)1、试剂得配制(1)1m

17、M盐酸羟胺溶液:称取.085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至30ml;(2)17mM对氨基苯磺酸溶液:称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液(冰醋酸:水=1:3配制)加热溶解后定容至400l;(3)7mM-萘胺溶液:称取0。400g萘胺用冰醋酸水溶液(冰醋酸:水=3:1配制)定容至40ml、实际配置PBS(、05,pH7.8):个处理*2个品种3次重复、5ml*3次测定27ml;(实际配置100 m)1mM盐酸羟胺溶液: 个处理2个品种3次重复ml*3次测定54;(实际配置100 ml,0.0095g)1mM对氨基苯磺酸: 个处理个品种*3次重复ml次测定=ml;(实际配置00 ml,0。2

18、44)m-萘胺溶液:3个处理个品种3次重复1ml3次测定=54ml;(实际配置100m,0。1004g)2、O。含量得测定()样品液提取方法同SO测定;(2)取0。5l提取液(酶液)(可视情况调整用量)中加入0.5ml S(0。05M,pH。8),1ml 1mM盐酸羟胺溶液后摇匀、(3)在2下保温1小时;(4)依次先加入ml 17M对氨基苯磺酸,再加入ml7mM-萘胺,混合后快速摇匀;(5)在25下保温2min后在3000g下离心3min后马上进行测定(或置于冰箱待测);(6)以对照管调零(用水调零),取粉红色水相液测定OD530值(测定);(7)2。含量得计算:由测得得O530,查NO2标准

19、曲线得到NO2;根据羟胺与O2、得反应式:OH2O.-H+ O2+H2O2 H2O 计算O2、-,即NO2-2=O2、;再根据样品与羟胺反应得时间与样品中得蛋白质含量,求得O2.-产生速率(以nml m-1mg1蛋白表示,也可以molmi1-1鲜重表示)。O2。产生速率(CV)/(tW) (nol i-1g鲜重)为标准曲线上查得得浓度(mo/L);V为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后得体积);为反应时间(0);W为样品鲜重(叶绿体实际质量g)参考文献:王爱国,罗广华.植物生理学通讯,190,(6):5557五、可溶性蛋白含量得测定(考马斯亮蓝染色法)1、试剂得配制(1)考马斯亮蓝溶液配制:称

20、取10g考马斯亮蓝,溶于50 ml 90乙醇中,加入10 m5%(/V)得磷酸,再用蒸馏水定容到1。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中,常温下可在暗中保存一个月、()100g/m牛血清蛋白(BSA)标准溶液:称取25g BSA加水溶解后定容至100 ml,再从中吸取40l用蒸馏水定容至100 ml(也可取10mgS定容至10ml即为1gl标准SA溶液)、实际配置0、0M,pH7。8磷酸缓冲液:3个处理*2个品种3次重复.08l*3次测定、56m;(实际配置0 m,)考马斯亮蓝溶液:3个处理*个品种次重复2。ml次测定=56。6l; (实际配置200 ml,20mg)2、样品可溶性蛋白含量得测定(1)样

21、品可溶性蛋白含量测定:取20l提取液(酶液)加入80l,0.05M,p7、8磷酸缓冲液(即稀释成.ml提取液),再加入2。ml考马斯亮蓝溶液,反应in后测D55(以100l缓冲液加2。9考马斯亮蓝为对照调零)。(2)蛋白质含量计算:可溶性蛋白质含量(mg/g)=(CVT)(S1000)C为标准曲线查得得蛋白质含量(g);T为提取液总体积(稀释后得体积ml);S为测定时所用提取液体积(,20l);W为样品鲜重(g)、过氧化氢(H2O2)含量得测定一、试剂配制:1、。2 ml/L l:取10.5gHO4溶解于。5L得水中;2、 mol/L OH:取2 g KH溶解于0.5L得水中;3、0、1 ml

22、/L,p 6、得磷酸缓冲液:Na2HO412H25、64g+aH2P4H2O、43g用去离子水定容到500ml;4、显色液:100L、0。1l/L、p 。5得磷酸缓冲液+ ,N二甲基苯胺+1g 4氨基氨替吡啉;、过氧化物酶溶液(20 UL)二、测定步骤:称取植株根与叶片组织各0。5g,分别置于研钵中,加入.6 mL预冷至4得0。2 ol/LHClO4,冰浴匀浆,于10 00离心5 in(4),取上清液,加4 mol KH调pH值为.5后,再于1000g离心5 min(4),取上清液1 L,加。 m显色液与0.1mL过氧化物酶溶液(25 /mL),用岛津UV1601分光光度计测定波长50 nm(

23、可见)处光密度值得变化,H2O2含量以l/表示、(用什么调零?)三、计算方法:(要做标线?)参考:过氧化氢(H2O2)含量得测定参照Uchda等(20)方法并加以改进、还原型谷胱苷肽GS2试剂配制(1)1M GSH标准液10mL(现用现配):称。073mgGS,加蒸馏水至。(不要)()5磺基水杨酸500mL:25g溶于500水中。(3)6M DNB:称取11905g DTN溶于5L PBS(0。1M,p7、5)中。(4)mM NADH:18.1mgNADPH溶于10m 中、()mMGSSG标准液10mL:6.126gG加PBS至10m、(不要)实际配置0.1M BS(pH 7.): 3个处理2

24、个品种3次重复*0.5ml次测定=27ml; (实际配置5 ml)6DTNB: 3个处理*2个品种*3次重复*、2ml*次测定10、ml; (实际配置0 m,实际用量。19)2M NDPH: 3个处理2个品种3次重复0、1l*次测定=5.4ml;(实际配置50 ml, 实际用量18、1g)(1U)R:3个处理2个品种次重复0、1ml3次测定=。ml; (实际配置50 , 实际用量10m)5%磺基水杨酸:3个处理个品种3次重复0。01ml3次测定0。54m;(实际配置10l)(实际用量、5/0ml)05mMPBS: 3个处理2个品种*3次重复*1.*3次测定=8ml;(实际配置100 ml)乙醚

25、(二乙醚): 3个处理2个品种3次重复ml*3次测定=4l;(实际配置000 m)PBS Bffer。M: 3个处理2个品种3次重复1。3次测定=81l;(实际配置150 ml)乙烯吡啶:个处理*2个品种3次重复*、2ml*次测定=1.l; (实际用量0 ml)乙醚: 个处理*2个品种*3次重复1ml3次测定=50ml;(实际用量100ml)1。标线制作:配制浓度为,.02mM,0.0mM,0.06,.0M,0M,0.12mM得标准GH溶液(吸取上述标准液各0.1mL)加入0。mL 0.1M磷酸钠Bfe(H、5)(含5mM EDA),0。2mL 6mM DTNB,、1mL 2mM ADPH,。

26、1m(1U)GR(谷胱甘肽还原酶)(sg),从0。1mL GSH启动反应,测定60s得A41(D42),绘制标准曲线。以PBS代替D作空白。3GSH(还原型谷胱甘肽)及GSSH(氧化型谷胱甘肽)(1)取1g新鲜叶片,加入0L(可以取g鲜样,加、l提取液)5%磺基水杨酸,研磨后在1400g离心10分钟,取1mL上清液,加入1、mL,0.5PB (pH、5)中,再用5mL乙醚(二乙醚)抽取二次(杂质会融到乙醚层中,而乙醚处于整个反应体系得上层,您直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可,反复进行两次即为抽取两次),此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。各取1上清液,加入.mL PB Buffer 。5m(pH7.5

27、),.2mL 乙烯吡啶(原装试剂浓度)混合至乳胶状,在2反应小时,再用5mL乙醚(原装试剂浓度)抽提次,此提取液用于分析SSGSSG氧化型谷胱甘肽, GSH还原型谷胱甘肽不能够直接测出,需测出氧化型与还原型谷胱甘肽含量,即总得谷胱甘肽含量,然后减去氧化型谷胱甘肽(SG)含量得到还原型谷胱甘肽含量(GS)(2)取反应混合液(0、5mL 0. PS(H 7、5)(内含5mM EDTA),。L6 T,0、1mL 2mM NADPH,0、1mL(1U)GR(sga),由加入0。ml提取液开始反应,测D12,在2下,反应0s(大约十分钟),分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。以不加DB,加相应剂量得BS作空

28、白。GR(谷胱苷肽还原酶)测定一、试剂配置50mM P()(pH7、0,含0、2mmo EDT,与APX得相同):K2HPO43H2O 6.96g+KH2P4 2、658混合后定容到1L;然后加入292。25、258.5gEDTA;mM GSSG(用水配):612.63100、0016。126g溶于1L水中;2。4mM NDPH(用PBS配):83。4.4。0012。溶于1L水中。实际配置50mM BS(K):3个处理2个品种*3次重复*1。3次测定91、8ml; (实际配置15ml,实际用量58。5g*.5=8.767)10mM GSS: 个处理2个品种次重复0。1ml次测定=5。ml;(实际配置0 l, 实际用量