抗氧化酶活性等测定方法.docx

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抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体得提取

一、试剂配置

１、PＢS提取液:

每L水依次加入MES（１9５.2×0。

05=９、7６g）、山梨糖醇（0。

33×182。

2＝60。

1２6g）、ＮaCｌ（０、０10×58.5=0、５85g）、MgCｌ（０.002×95=0、19g）、EDＴA（292、２5×０.0０２=０、５84５g）、KH2PO４（２00×0.0005=０、１g）;使用时加入ASＡ—Nａ（１98。

1×0、00２=0、３962g）;

2、悬浮液:

将ＰBS提取液中得MES换为238。

３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS（238、3×０。

05=11。

915ｇ）;

３、8０%Pｅrｃoｌ:

8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:

４0ｍl原液＋60ml水;

实际配制:

PBS提取液2000ｍl（3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ）,　

悬浮液100ml（３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml）;

8０％Percol２０0ml;　40%Percｏl200ml。

（3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl）

二、提取步骤

1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS（50mM　MESPH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mMNaＣl,2mM　ＭgCｌ２,２ｍM　EＤTA,０.5mMKH2PＯ４,2mM　ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加）

2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣（注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎）

3、滤液20００g３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值（水平转头,加速度调到9）,约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成;

4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物;

5、用1ml悬浮液（５０mMHＥPＥSpＨ7。

6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM　NaＣl,2mMMgＣl2,2mMEDTA,0。

5　mMKH2PＯ４,2mM　ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。

叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。

6、２000g1min;

7、沉淀再用悬浮液悬浮;（悬浮液同5,可以不做）

8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心（将3ml含有80％Peｒcｏl（原液按100％算）铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层）１500ｇ　2-3mｉn（用水平离心头得离心机,离心机加速要缓慢上升,加速度调到１）,下降也要缓慢下降,否则会破碎Perｃoｌ得浓度梯度层得形成,取出会瞧到３层绿色带,最上层为破碎得叶绿体,沉在地层得为粗颗粒,40－80％得Peｒcol之间得界面有一层绿色层为完整得叶绿体;

9、小心吸出,转移到悬浮介质中,使叶绿体浓度达到1mg.mｌ—1;（计算:

取叶绿体悬浮液0.1mｌ,加4.9ml　８０%得丙酮,摇匀后于１0０0g离心2ｍin,上清液置于１ｃm得比色杯,在６25nｍ上比色,按照公式计算:

OＤ6２5ｎm×５０/34.５＝叶绿素ｍg/mｌ）

10、测定叶绿体得完整性,完整率达到８５-95%;

参考:

TakedａK,　Otaubo　T,KｏndaN.Ｐarticipaｔionofhydｒogenｐeroｘｉdeiｎtheinactiｖation　ｏfCａｌｖin—cycleSHｅnzymein　ｓo2—furmugaｔｅdｓｐｉnacｈleaves。

Plant　andcellPhｙsioｌogy,１982,２3:

1009—1018。

取上述制备得完整叶绿体进行如下测定:

1、用５0mM　PBS（保护酶或其她测定项目得缓冲液）稀释2－5倍,用于测定SOD、POＤ、CAT、ＡPX;

2、用冷丙酮稀释2倍,取0。

5MＬ提取液用于测定H２Ｏ2;（本试验中用０。

2　mｏl/LＨClＯ４稀释）

3、用5％得TCA稀释2-5倍,取1。

5ml用于测定MDA;

4、用乙醇:

丙酮:

水=4。

5:

4。

5:

1稀释,用于测定叶绿素;

抗氧化酶（SＯＤ、ＰＯD、CＡT、APX）活性测定方法

一、超氧化物歧化酶（ＳOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂得配制

（1）0.０5mｏl/Ｌ磷酸缓冲液（ＰBS,pＨ7。

8）:

A母液:

0。

2mol/L磷酸氢二钠溶液:

取Na2HPO4·12Ｈ2O（分子量358.14）71．7g;

Ｂ母液:

0.2ｍol／Ｌ磷酸二氢钠溶液:

取NaＨ2PO4·２H2O（分子量156.01）31.２g。

分别用蒸馏水定容到10０0ml。

0、05moｌ/LＰBS（pH7、8）得配制:

分别取A母液（Nａ２HＰO４）228。

75mｌ,B母液（ＮaＨ2PO4）2１.25ml,用蒸馏水定容至１0０0ｍl、

参考文献:

李合生主编:

植物生理生化实验原理与技术。

高等教育出版社,2０00:

26７～26８。

（2）14。

5mM甲硫氨酸溶液:

取2、１637g　Meｔ用磷酸缓冲液（pＨ7。

８）定容至１0０0ml。

（３）3０μM　EDＴA－Ｎa2溶液:

取０。

001gＥDTＡ-Na２用磷酸缓冲液定容至100ml、

（4）60μＭ核黄素溶液:

取０、0０２3ｇ核黄素用磷酸缓冲液定容至100ｍl,避光保存。

（5）２。

25ｍM氮蓝四唑（ＮBT）溶液:

取0。

1840gNBT用ＰＢS定容至100ml,避光保存。

（上述试剂先配好,放到４度冰箱,用之前临时按下面得方法配,然后放在4度冰箱中,不要在最上层,避免见光,第一组样品加好后拿出来加,加完后放回冰箱,第二组得样品加好后再拿出来加）

酶液制备:

取0。

２g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷得研钵中,加入1。

6mｌ50ｍmｏｌ/Ｌ预冷得磷酸缓冲液（pH7、8）在冰浴上研磨成匀浆,转入离心管中在4℃、1２000g下离心20min,上清液即为酶液。

2、酶活性测定

（1）反应混合液配制（以60个样为准）:

分别取Mｅt溶液１６2ml,ＥDＴA－Ｎａ2溶液0.６mｌ（加得量与前面得浓度要核对）,磷酸缓冲液5、4ml,NBT溶液６mｌ,核黄素溶液6ｍl,混合后摇匀;

SＯD反应混合液:

3个处理*２个品种＊3次重复*3mｌ＊３次测定=162ml（实际配置２0０ml）

（2）分别取3ｍｌ反应混合液与30μl（可视情况调整,最好先做一个浓度梯度,瞧加多少合适,如果量太少,最好稀释后再加,这样精确）酶液于试管中（尽可能加到试管得底部,要靠着试管壁打下去先加酶液,后加反应液,加好后摇一摇,瞧瞧试管上就是不就是有雾气,最好拿纱布把试管下边擦一下,免得雾气挡住光线照过去）;

（3）将试管置于光照培养箱中在4０0０lux光照下反应2０min;（照光很重要,试管要选择相同规格得,因为不同得试管透光率就是不一样得,试管架不要选择遮光得,这个最好分组做,同时几组做相互之间会遮光,每一组一个重复,就就是每一组中都要有所有得处理,且都要有一个最大管,处理多得话,把根与叶分开做,最大管放在中间）

同时做两支对照管,其中１支试管取3mｌ反应混合液加入３0μlPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管,另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光得对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后,避光测OＤ5６０（出现颜色即可测定）。

（5）酶活性计算:

ＳOD活性单位以抑制NＢＴ光化还原50％所需酶量（测得样品值要在最大管得一半左右才合适,否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOＤ总活性＝［（Ack－AE）×V］／（１/２Aｃk×W×Vt）

ＳＯＤ比活力=SOD总活性/蛋白质含量

SOＤ总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gＦW）;比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示;Ack为照光对照管得吸光度;ＡE为样品管得吸光度;Ｖ为样品液总体积（ml,1、6ml,加入PBS得体积）;Vt为测定时得酶液用量（ml,30ul）;W为样品鲜重（g,测定时应换算为叶绿体得质量mg）;蛋白质含量单位为mg／ｇ。

二、PＯＤ、CAT酶活性得测定

粗酶液制备同SOD。

1、过氧化物酶（ＰOD）活性测定（愈创木酚法）

（1）试剂配制:

0、２moｌ/L磷酸缓冲液（pH6、0）:

分别取A母液（Na２HＰＯ4）12３ｍl与B母液（NaH2PＯ4　）　877mｌ混匀即为1000mlＰBS（0。

２Ｍ,pH6、0）;

（２）反应混合液配制（以60个样为准）:

取2０0ｍlPBS（0。

2M,pH６、0）,加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（２－甲氧基酚）加热搅拌溶解,冷却后加入0。

1１2ml　30％得H２O2,混匀后保存于冰箱中备用。

PＯD反应混合液:

3个处理＊2个品种＊3次重复＊3ｍｌ＊3次测定=1６2ml（实际配置200ｍl,0.076ml,0、112ml）

（3）样品测定:

取3ml反应液并加入30μｌ酶液,以PBS为对照调零,而后测定OD470值（测定４0秒）。

（边加样边测定,测定前等待5秒,动作要快,如果慢得话,要保证每个样品从加好样到开始记时得时间相差不大）

（4）酶活性计算:

以每ｍｉnOＤ值变化（升高）0、０1为1个酶活性单位（u）、

POＤ=（ΔA４70×Vt）/（Ｗ×Vs×0、01×t）　　（u/gmiｎ）

ΔA4７0:

为反应时间内吸光度得变化;Ｗ为样品鲜重（ｇ）;ｔ为反应时间（min）;Vt为提取酶液总体积（ml,（1.６ml）;Ｖs为测定时取用酶液体积（ml,30ul）。

2、过氧化氢酶（CAT）活性测定

（1）试剂配制:

0、１5mｏｌ／L磷酸缓冲液（pH7。

０）:

取A母液（Nａ2HPO4）457、5ml与B母液（NaH2PO４）29２。

５　ｍl混合后用蒸馏水定容至1000ml、

（２）反应液配制:

取20０mlＰＢS（０、1５M,pＨ7.0）,加入0、３092ｍl30%得H2O２（原液）摇匀即可。

ＣAT反应液:

3个处理*２个品种＊3次重复*3ｍｌ*3次测定=162ｍｌ（实际配置200ml,0、３０92ml）

（３）样品测定:

取3ml反应液加入0.1ｍｌ（可视情况调整）酶液,以PBS为对照调零,测定OＤ２40（紫外）（测定40s）。

（４）酶活性计算:

以每minＯＤ值减少0。

０1为1个酶活性单位（u）、

ＣＡT=［ΔA240×Ｖt　]/（W×Vｓ×0。

0１×ｔ）　（u／ｇmin）

ΔA240:

为反应时间内吸光度得变化;W为样品鲜重（g）;t为反应时间（ｍiｎ）;Ｖｔ为提取酶液总体积（ml,1、6ml）;Ｖs为测定时取用酶液体积（mｌ,0。

1ｍl）。

三、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性得测定（缓冲液为K）ﻩ

1、试剂配制（按５０个样计算）:

（１）0。

０5　mｏｌ/LK2HPＯ4-KH2PO4缓冲液（pH7。

0）得配制:

（A）K2HPＯ4·３H２Ｏ:

２28。

22×0、05×0.6１=６.96０７g

（B）KH2PO４:

　　136。

09×0。

０５×0。

39=2、65３8g,以上两者混合起来用去离子水定容到１L、

（2）０、1ｍMEDTA－Ｎa2:

取0、018６1g　EDＴA-Na2用PＢＳ溶液定容到5０0　ml（372、2４g/M×0.1mＭ×500ml=０、０1８61g）;

（3）5mMＡsA:

取0。

0４4ｇ抗坏血酸用PBS溶液定容到50ml（现用现配,1７6.13g/M5ｍM×5０ml=0.0４4g）;

（４）2０mMH2O２:

取0.2ｍl,30％H２Ｏ2用去离子水稀释到10０ml（3０％H2O2为5５0g×３0％/（34、0１g／M×0、5Ｌ）＝9、７03M）、

实际配置

0、1mＭＥDTA-Na2:

3个处理＊2个品种*3次重复＊１、７ml＊3次测定=９1、8ｍl;（实际配置25０　ml,0。

0０９305g）

５ｍM得ＡsA:

　３个处理＊2个品种*３次重复＊0。

1ml＊3次测定=5。

4ｍｌ;（实际配置50ml,0。

044g）

２0mMＨ2Ｏ2:

3个处理*2个品种＊3次重复*0、1ｍl*3次测定=5。

4ml;（实际配置50　ｍｌ,0。

1ml）

２、酶活性得测定（以2ml体系测定）

（1）取0、10ml酶液（可视情况调整）,加入１。

７0ml　含0。

１　mMＥＤTA－Na2得PBS（０、05mｏl／Ｌ,pＨ７。

０）,再加入0。

1０　ml5　mM得ＡsA,最后加入０、１0ml2０mＭH2O2,立即在20℃下测定Ｄ２9０（紫外）值在40s内（测定时间内变化大可测定得时间短点,否则长点）得变化,计算单位时间内AsA减少量与酶活性（室温下测定,缓冲液调零）。

计算公式:

　△OD/△t×Vｒ×VT

A×ｄ×Ｖｔ×W

△OD为反应时间内吸光度得变化（40秒吸光度－0秒吸光度）;△t为反应时间（40秒）;Ｖｒ为反应液体积（2mL）;VT提取液体积（１。

6ｍL）;A为消光系数（２、8ｍM-1.ｃm-1）;d为比色杯厚度（1ｃm）;Vt测定液体积（0。

1mL）;W为样品鲜重（0。

2g）。

四、超氧阴离子自由基（O2。

-）产生速率得测定（羟胺氧化法）

1、试剂得配制

（1）1mM盐酸羟胺溶液:

称取０.0２０85g盐酸羟胺用蒸馏水定容至3０0ml;

（2）17mM对氨基苯磺酸溶液:

称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸:

水=1:

3配制）加热溶解后定容至400ｍl;

（3）7mMα-萘胺溶液:

称取0。

400８gα－萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸:

水=3:

1配制）定容至40０ml、

实际配置

PBS（０、05Ｍ,pH7.8）:

　３个处理*2个品种＊3次重复＊０、5ml*3次测定＝27ml;（实际配置100mｌ）

1mM盐酸羟胺溶液:

３个处理＊2个品种＊3次重复＊１ml*3次测定＝54ｍｌ;（实际配置100ml,0.00６95g）

1７mM对氨基苯磺酸:

３个处理＊２个品种*3次重复＊１ml＊３次测定=５４ml;（实际配置１00ml,0。

2９44ｇ）７mＭα-萘胺溶液:

3个处理＊２个品种＊3次重复＊1ml＊3次测定=54ml;（实际配置100　mｌ,0。

1004g）

2、O２。

－含量得测定

（１）样品液提取方法同SOＤ测定;

（2）取0。

5ｍl提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5mlＰＢS（0。

05M,pH７。

8）,1ml1mM盐酸羟胺溶液后摇匀、

（3）在2５℃下保温1小时;

（4）依次先加入１ml17ｍM对氨基苯磺酸,再加入１ml　7mM　α-萘胺,混合后快速摇匀;

（5）在25℃下保温2０min后在3000×g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）;

（6）以对照管调零（用水调零）,取粉红色水相液测定OD530值（测定）;

（7）Ｏ2。

—含量得计算:

由测得得OＤ530,查NO2－标准曲线得到［NO2－];根据羟胺与O2、—得反应式:

ＮＨ２OH＋2O２.-＋H+　　ＮO2—+H2O2＋H2O计算［O2、-］,即[NO2-］×2=[O2、—］;再根据样品与羟胺反应得时间与样品中得蛋白质含量,求得O2.-产生速率（以nmｏlmｉｎ-1mg—1蛋白表示,也可以ｎmol　miｎ－1ｇ-1鲜重表示）。

O2。

—产生速率＝（C×V）/（t×W）（nｍolｍiｎ-1g—１鲜重）

Ｃ为标准曲线上查得得浓度（ｕmoｌ/L）;V为测定时所取提取液用量（叶绿体稀释后得体积）;ｔ为反应时间（６0ｍｉｎ）;W为样品鲜重（叶绿体实际质量g）

参考文献:

王爱国,罗广华.植物生理学通讯,1９90,（6）:

55～57

五、可溶性蛋白含量得测定（考马斯亮蓝染色法）

1、试剂得配制

（1）考马斯亮蓝溶液配制:

称取10０　ｍg考马斯亮蓝,溶于50ml90％乙醇中,加入10０mｌ　８5%（Ｗ/V）得磷酸,再用蒸馏水定容到1Ｌ。

在过夜后过滤并贮于棕色瓶中,常温下可在暗中保存一个月、

（２）100μg/mｌ牛血清蛋白（BSA）标准溶液:

称取25ｍgBSA加水溶解后定容至100ml,再从中吸取40ｍl用蒸馏水定容至100ml（也可取10mg　ＢSＡ定容至1０0ml即为1００μg／ｍl标准ＢSA溶液）、

实际配置

0、0５M,pH7。

8磷酸缓冲液:

3个处理*2个品种＊3次重复＊０.08ｍl*3次测定＝０、３４56mｌ;（实际配置１0０mｌ,）

考马斯亮蓝溶液:

　3个处理*２个品种＊３次重复＊2。

９ml＊３次测定=１56。

6ｍl;（实际配置200ml,20mg）

2、样品可溶性蛋白含量得测定

（1）样品可溶性蛋白含量测定:

取20μl提取液（酶液）加入80μl,0.05M,pＨ7、8磷酸缓冲液（即稀释成０.１ml提取液）,再加入2。

９ml考马斯亮蓝溶液,反应２ｍin后测ＯD5９5（以100μl缓冲液加2。

9ｍｌ考马斯亮蓝为对照调零）。

（2）蛋白质含量计算:

可溶性蛋白质含量（mg/g）=（C×VT）／（Ｗ×ＶS×1000）

C为标准曲线查得得蛋白质含量（μg）;ＶT为提取液总体积（稀释后得体积ml）;ＶS为测定时所用提取液体积（ｍｌ,20μl）;W为样品鲜重（g）、

过氧化氢（H2O2）含量得测定

一、试剂配制:

1、０。

2mｏl/LＨＣlＯ４:

取10.０5g　HＣｌO4溶解于０。

5L得水中;

2、４mol/LＫOH:

取１１2gKＯH溶解于0.5L得水中;

3、0、1mｏl/L,pＨ6、５得磷酸缓冲液:

Na2HＰO4·12H2Ｏ5、64０７g+ＮaH2PＯ4·２H2O５、３4３3g用去离子水定容到500ml;

4、显色液:

100ｍL、0。

1　ｍｏl/L、pＨ６。

5得磷酸缓冲液+２５μＬ　Ｎ,N－二甲基苯胺+1０　ｍg4－氨基氨替吡啉;

５、过氧化物酶溶液（2５0U／ｍL）

二、测定步骤:

称取植株根与叶片组织各0。

5g,分别置于研钵中,加入１.6mL预冷至4℃得0。

2ｍol/L　HClO4,冰浴匀浆,于1000０×ｇ离心5ｍin（4℃）,取上清液,加4mol／ＬKＯH调pH值为７.5后,再于10　00０×g离心5min（4℃）,取上清液1ｍL,加０。

４mＬ显色液与0.1mL过氧化物酶溶液（25０Ｕ/mL）,用岛津UV－1601分光光度计测定波长５50nm（可见）处光密度值得变化,H2O2含量以μｍｏl/ｇＦＷ表示、（用什么调零?

）

三、计算方法:

（要做标线?

）

参考:

过氧化氢（H2O2）含量得测定参照Uchｉda等（20０２）方法并加以改进、

还原型谷胱苷肽GSＨ

2．试剂配制

（1）1ｍMGSH标准液10mL（现用现配）:

称３。

07３3mgGSＨ,加蒸馏水至１０ｍＬ。

（不要）

（２）5％磺基水杨酸500mL:

25g溶于500ｍＬ水中。

（3）6ｍMDＴNB:

称取０．11８905gDTNＢ溶于5０ｍLPBS（0。

1M,pＨ7、5）中。

（4）２mMNADＰH:

18.1mg　NADPH溶于10mＬＰＢＳ中、

（５）１mMGSSG标准液10mL:

6.126ｍg　ＧＳＳG加PBS至10mＬ、（不要）

实际配置

0.1MＰBS（pH7.５）:

3个处理＊2个品种＊3次重复*0.5ml＊３次测定=27ml;（实际配置5０ml）

6ｍＭ　DTNB:

3个处理*2个品种*3次重复*０、2ml*３次测定＝10、８ml;（实际配置５0mｌ,实际用量０。

1１８9ｇ）

2ｍMNＡDPH:

3个处理＊2个品种＊3次重复＊0、1ｍl*３次测定=5.4ml;（实际配置50ml,实际用量18、1ｍg）

（1U）ＧRⅢ:

　3个处理＊2个品种＊３次重复＊0、1ml＊3次测定=５。

４ml;（实际配置50ｍｌ,实际用量10mｌ）

5%磺基水杨酸:

3个处理＊２个品种＊3次重复＊0。

01ml＊3次测定＝0。

54mｌ;（实际配置10ｍl）（实际用量０、5ｇ/１0ml）

0．5mM　PBS:

3个处理＊2个品种*3次重复*1.５ｍｌ*3次测定=8１ml;　（实际配置100ml）

乙醚（二乙醚）:

3个处理＊2个品种＊3次重复＊１０ml*3次测定=５4０ｍl;　（实际配置１000mｌ）

PBSBｕffer　０。

５ｍM:

3个处理＊2个品种＊3次重复＊1。

５ｍｌ＊3次测定=81ｍl;　（实际配置150ml）

２—乙烯吡啶:

　３个处理*2个品种＊3次重复*０、2ml*３次测定=1０.８ｍl;（实际用量２0ml）

乙醚:

３个处理*2个品种*3次重复＊1０ml＊3次测定=5４0ml;　（实际用量1０00　ml）

1。

标线制作:

配制浓度为０,０.02mM,0.0４mM,0.06ｍＭ,０.0８ｍM,0．１ｍM,0.12mM得标准GＳH溶液（吸取上述标准液各0.1mL）加入0。

５mL0.1M磷酸钠Bｕfｆeｒ（ｐH７、5）（含5mMEDＴA）,0。

2mL6mMDTNB,０、1mL2mMＮADPH,０。

1mＬ（1U）GRⅢ（谷胱甘肽还原酶）（sｉgｍａ）,从0。

1mLGSH启动反应,测定6５0s得A41２（ＯD4１2）,绘制标准曲线。

以PBS代替DＴＮＢ作空白。

3．GSH（还原型谷胱甘肽）及GSSH（氧化型谷胱甘肽）

（1）取1g新鲜叶片,加入１0µL（可以取０．２g鲜样,加１、６ｍl提取液）5%磺基水杨酸,研磨后在1400０g离心10分钟,取1mL上清液,加入1、５mL,0.5ｍＭ　PBＳ（pH７、5）中,再用5mL乙醚（二乙醚）抽取二次（杂质会融到乙醚层中,而乙醚处于整个反应体系得上层,您直接用枪吸取上层乙醚丢弃即可,反复进行两次即为抽取两次）,此提取液用于分析总谷胱苷肽含量。

各取1ｍＬ上清液,加入１.５mLPBＳBuffer０。

5mＭ　（pH7.5）,０.2mL２—乙烯吡啶（原装试剂浓度）混合至乳胶状,在2５℃反应１小时,再用5mL乙醚（原装试剂浓度）抽提２次,此提取液用于分析ＧSSＧ『GSSG－氧化型谷胱甘肽,GSH－还原型谷胱甘肽不能够直接测出,需测出氧化型与还原型谷胱甘肽含量,即总得谷胱甘肽含量,然后减去氧化型谷胱甘肽（ＧSＳG）含量得到还原型谷胱甘肽含量（GSＨ））

（2）取反应混合液（0、5mL0.１ＭPＢS（ｐH7、5）（内含5mMEDTA）,０。

２ｍL　6ｍＭＤTＮＢ,0、1mL2mMNADPH,0、1mL（1U）GRⅢ（sｉgｍa）,由加入0。

１ml提取液开始反应,测ＯD４12,在2５℃下,反应６５0s（大约十分钟）,分别计算总谷胱苷肽及GSH含量。

以不加DＴＮB,加相应剂量得ＰBS作空白。

GR（谷胱苷肽还原酶）测定

一、试剂配置

50mMPＢＳ（Ｋ）（pH　7、0,含0、2mmoｌEDTＡ,与APX得相同）:

K2HPO4·3H2O6.96０７g+KH2PＯ42、65３8ｇ混合后定容到1L;然后加入292。

25×０、2＝58.４5gEDTA;

１０mMGSSG（用水配）:

612.63×10×0、001＝6。

126g溶于1L水中;

2。

4mMNＡDPH（用PBS配）:

8３3。

4×２.4×０。

001＝2。

０ｇ溶于1L水中。

实际配置

50mMＰBS（K）:

　3个处理＊2个品种*3次重复*1。

７ｍｌ＊3次测定＝91、8ml;（实际配置15０　ml,　实际用量58。

４5g*０.１5=8.767５ｇ）

10mMGSSＧ:

３个处理＊2个品种＊３次重复＊0。

1ml＊３次测定=5。

４ml;　（实际配置５0ｍl,实际用量