分子生物学实验.docx

1、分子生物学实验实验一 感受态细胞制备 （4学时）一、实验目的：通过本实验，把握大肠杆菌感受态细胞制备的方式和技术。二、实验原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。其原理是细菌处于0、CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。三、仪器、材料和试剂（一）仪器：1.超净工作台 2.离心机 3.恒温摇床 4.高压灭菌锅 5.移液枪 6.振荡器7.天平 8.恒温水浴 9.离心管 10.锥形瓶（二）材料：大肠杆菌DH5 （三）试剂：1. l CaCl2溶液 2. LB液体培育基 %酒精四、实验步骤1.从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于3ml LB液体培育基的试管中，37震荡培育留宿。2.取1

2、 ml菌夜转接到一个含有50ml LB液体培育基的锥形瓶中，37震荡培育2-3h（现在，A600应在之间，细胞数务必108/ml，此为实验成功的关键）。3.用移液枪取2ml菌液转移到离心管中，冰上放置10min。（1000l的枪，蓝色枪头，旋转不要太快，不能超过量程，每组至少做6管）4.离心10min（4000r/min）。（离心机，严禁空转和不平稳，利用之前用太平平稳，对称放。上离心机之前，用卫生纸擦离心管。不要贴标签。用记号笔标记就能够够。盖紧离心管口。盖好离心机内盖）5.倒出培育液，将管倒置1min，以使培育液流尽。（在超净工作台中操作）6.用冰凉的l CaCl2 200l悬浮沉淀（用振

3、荡器），当即放在冰上保温30min。（200l的枪，黄色枪头）7.低温离心10min（4000r/min），回收细胞。8.用冰凉的l CaCl2 200l悬浮细胞（用振荡器）。9.分装细胞，毎200ul一份，此细胞为感受态细胞。五、实验结果： 有白色细胞细胞沉淀显现，该白色沉淀即为大肠杆菌感受态细胞。六、分析讨论：1.什么缘故实验步骤中A600应在之间，细胞数务必108/ml？2.步骤6和8中都加入了CaCl2目的一样吗？它们的作用别离是什么？3.本实验的注意事项有哪些？实验二 阳性克隆的挑选与鉴定、质粒DNA的提取（5学时）一、实验目的：通过本实验学习和把握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的

4、挑选与鉴定方式。二、实验原理：一、蓝白斑挑选原理二、碱裂解法提取质粒是依照共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的不同而达到分离目的。三、仪器、材料、试剂 (一)仪器：一、恒温摇床 二、台式离心机 3、高压灭菌锅 4、振荡器(二)材料：一、 含PUC-18质粒的大肠杆菌 二、乙二胺四乙酸(EDTA) 3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 八、冰醋酸(HAc) 九、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚 1一、氯仿 1二、异戊醇 13、乙醇 14、胰RNA酶 1五、羧苄青霉素1六、离心管(三)试剂

5、：一、溶液 二、溶液 3、溶液 4、TE缓冲液 五、LEDTA 六、氯仿:异戊醇(V:V=24:1) 7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1) 八、70%乙醇 九、胰RNA酶 四、实验步骤一、先在3mL LB液体培育基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL)，然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37震荡培育留宿。二、取留宿培育的菌液2mL加入离心管中，4000r/min，倒出培育液，将所有菌体细胞搜集在离心管中。（每组至少做6管）3、加入100l溶液于含菌体细胞的离心管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。4、加入200l溶液(新鲜配置)，轻轻

6、混匀内容物，溶液慢慢变清亮后加入溶液(万万不可用旋涡震荡器，裂解时刻不超过5min)。5、加入150l溶液(冰上预冷)，盖紧管口，轻轻混匀数次。冰上放置15min让质粒DNA复性(万万不可用旋涡震荡器)。6、12000r/min离心10min，将上清转至另一个离心管中。（注意用枪取，记着取多少）7、向上清中加入等体积饱和酚：氯仿：异戊醇溶液，旋涡混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中。8、向上清中加入等体积氯仿：异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，将上清转移到另一个离心管中。9、向上清中加入2倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置30min。12000r/

7、min离心10min，吸去上清液。10、用200l 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀1次(12000r/min离心5min)，倒去上清液，空气中干燥。1一、加入20uLRTE，使质粒DNA完全溶解。五、实验结果 有白色质粒沉淀，然后又溶解。六、分析讨论1、溶液、溶液、溶液的作用别离是什么?2、什么缘故真核生物基因组DNA不能用碱裂解法提取?3、本实验需要把握哪些知识和技术？实验三 目标基因的5-结尾的PCR扩增、3-结尾的PCR扩增一、实验目的：学习和把握用RACE方式扩增cDNA的5-结尾和3-结尾的方式和技术。二、实验原理：一、聚合酶链反映的原理：类似于DNA的天然复制进程。包括高温变性（94

8、oC）、低温退火（50o- 60oC）、中温延伸（72oC）三个时期。二、电泳技术原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子量（片段）越小，其在电泳中跑的越快；构型越稳固，跑的越快。三、仪器、材料、试剂：热循环仪 2.琼脂糖凝胶电泳系统 3.紫外透射仪 管、移液枪模板 混合物 7.引物对(正向引物和反向引物) 酶9.琼脂糖 10. TBE 11. 10PCR buffer 12. loading buffer四、实验步骤：1.依照模板，设计引物。2.在PCR管内配制100 l反映体系。 双蒸水 70 l10PCR buffer 10 l mmol/L dNTP混合物 8

9、l正向引物 4 l反向引物 4 l 模板DNA 2 l Taq聚合酶 2 l 3. 依照条件，设计PCR程序，进行扩增 94 oC 预变性 2min 94 oC 变性 30s 55 oC 退火 30s72 oC 延伸 1min重复步骤(2)、(3)、(4) 30次 72 oC 总延伸2min4.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，并架好样品梳子。制胶：配制适宜浓度的琼脂糖凝胶。准确称量 g琼脂糖干粉，放入洗好的锥形瓶内，加入15 ml 倍的TBE（用量筒量取）。然后，用纸盖着锥形瓶的口，放入微波炉内加热熔化，然后冷却片刻，加入1l染色剂，混匀，然后倒入架好

10、的有机玻璃内槽内中，待其凝固。（先熔化30s，然后摇匀，再熔化。倒的时候若是有气泡，用枪头处置）拔梳子：室温下20-30 min后，有机玻璃内槽的凝胶形成一层均匀的胶面，警惕拔出梳子。将有机玻璃内槽连同凝胶掏出，放入电泳槽内。向电泳槽内加入电泳缓冲液（倍的TBE），其量以没过胶面1mm为宜（约42 ml，量筒取）。加样：别离取20 l DNA和20 l Loading-buffer混匀，用移液枪将混匀的样品缓缓加入点样孔中。（每组点样5-6个孔）接通电源，红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极向正极移动，一样选择80 V电压，电泳时刻为30 min。当溴酚蓝移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停

11、止电泳。电泳完毕，关上电源，掏出凝胶，在染色室紫外透射仪下观看结果。（注意要带上手套，不要把有机玻璃内槽拿到染色室）五、实验结果： 基因存在处显示出绿色荧光条带。六、分析讨论：1. PCR技术的原理？2. RACE技术的原理？实验四 目标产物的回收与纯化（4学时）一、实验目的：学习和把握回收纯化DNA的方式和技术。二、实验原理：采纳平稳酚抽提，无水乙醇和醋酸钠沉淀法，回收纯化DNA。三、仪器、材料和试剂（一）仪器：1.离心机 2.琼脂糖凝胶电泳系统 3.紫外透射仪4.移液枪（二）材料：PCR产物 （三）试剂： 饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1) 2.氯仿:异戊醇(V:V=24:

12、1) 醋酸钠（ 4.无水乙醇 %酒精缓冲液四、实验步骤lPCR产物补水至200l，加等体积（200l）的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，取上清（约120l）。2.加等体积氯仿:异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，取上清（约100l）。3.加等体积无水乙醇（冰上预冷）和1/10体积3M醋酸钠（，充分混匀（漩涡混匀或用手摇200次），沉淀DNA。4.手动短时离心3-5s，冰上沉淀30min。min离心10min，弃上清。6. 用200l 70%乙醇洗涤沉淀1次(12000r/min离心5min)，弃上清，空气中干燥。7. 加入20l TE，

13、溶解。8.电泳检测。五、实验结果 基因存在处显示绿色荧光条带。六、分析讨论1. 如何纯化PCR产物或粗提的DNA？实验五 PCR产物与载体的连接、连接产物的转化（5学时）一、实验目的：学习和把握DNA重组和重组子鉴定的方式。二、实验原理：酶切连接转化蓝白斑挑选。三、实验仪器、材料和试剂：1、恒温摇床 二、离心机 3、超净工作台 4、恒温水浴 五、移液枪 六、LB液体培育基 7、LB固体培育基八、IPTG 九、X-gal 10、质粒 1一、感受态细胞 1二、酶切分子试剂Ecor I 13、solution I （含目的基因和连接酶）四、实验步骤（一）质粒DNA的制备（二）目的基因的取得（solu

14、tion I含目的基因和连接酶）（三）质粒DNA酶切1.别离取两管酶切反映体系：5l质粒+5ul Ecor I酶+5l酶切反映液+5l无菌水。2.短时离心混匀（10 S之内）。3. 37保温1h。（四）载体和目的基因的连接1.取两管10l反映体系：5l酶切产物+5l Solution，混匀，16水浴1h。（五）连接产物的转化1.取感受态细胞200l，加入10l连接产物，冰浴30min。2.热激：42保温90s。3.冰浴2min。4.加入800l LB液体培育基，37慢摇苏醒30min，同时在超净工作台上制作选择平板。（六）重组子的鉴定（蓝白斑挑选）1.将苏醒菌液4000r/min离心1min，

15、先吸去800l上清液，再将细胞吹散成细胞悬液，取50l细胞悬液直接涂布在含有羧苄青霉素、X-gal、IPTG的选择平板上。2.将平板（培育皿）正向放置30min至液体被吸收，倒置平皿37培育16h，显现菌落，其中白色菌落为重组质粒。五、实验结果：显现的白色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。六、分析讨论：1.蓝白斑挑选的原理？实验六 克隆片段的鉴定（5学时）一、实验目的：学习和把握重组克隆的鉴定方式。二、实验原理：克隆位点双侧别离有EcoR I和Hind III酶切位点，因此这两种酶能够将插入片段从克隆载体中切割下来。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，能够观看插入片段的大小。三、仪器、材料、试剂1.

16、 实验仪器离心机、移液枪；制冰机；电泳仪；紫外透射仪。2. 材料质粒载体。3. 试剂限制性内切酶EcoR I和Hind III。四、实验步骤1.挑取生长较好的单菌落，导入装有2ml LB液体培育基的离心管中，在恒温摇床培育1h。（37，200转）2.提取质粒。3. 用EcoRI和Hind III内切酶双酶切插入有外源片段的质粒载体，按以下体系配置反映液： 双酶切反映体系（50l）反应成分reaction ingredient 体积volume 10H Buffer 10 l质粒DNA 20 lEcoRI酶 5 l Hind III酶 5 lddH2O 10 l 4. 混匀后，手动离心3-5s，

17、置37反映1h，反映终止后，电泳检测。五、实验结果：基因存在处显示两条绿色荧光条带。六、分析讨论1. 进行双酶切反映注意哪些问题？实验七-酵母表达载体的构建（11个学时）CTAB法提取植物基因组DNA一、实验目的：通过本实验学习从植物基因组中提取DNA的方式和实验技术。二、实验原理CTAB在高离子强度的溶液中( mol/L NaCl) 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。EDTA抑制DNA酶的活性。再用氯仿/异戊醇抽提的方式去除蛋白质，取得的DNA溶液经NaAC和异丙醇沉淀。三、仪器、材料、试剂（一）仪器 恒温水浴锅，离心机，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪（二）材料 幼嫩的烟草

18、叶片，CTAB，EDTA，NaCl，Tris，2 mL离心管，枪头等。（三）试剂 1、CTAB缓冲液； 2、3 M NaAc； 3、氯仿/异丙醇=24;1； 4、70 %酒精。四、实验步骤1、CTAB缓冲液置于 65 水浴锅中温浴1 h；2、取幼嫩的烟草叶片置于研钵中，加入2 mL CTAB缓冲液充分研磨；3、将研磨后的匀浆别离装在离心管中（注意每一个离心管中只装1 mL的匀浆），65 水浴1 h，中间倒置混匀4-5次；4、加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），倒置混匀5 min；3、12000 rpm离心15 min；4、取上层液体，加入80 l 3M NaAc和800 l异丙醇，倒置混匀后

19、室温静置15min；5、12000 rpm离心15 min；6、弃上清，加入500 l 70 %酒精洗沉淀一次；7、12000 rpm离心5 min；8、弃上清，沉淀在室温下干燥20-30 min后加入30 l ddH2O溶解DNA。9、取3-5 l新提取的DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，其余的样品保留在-20 冰箱中备用。五、实验结果提取取得的DNA应为一条带，若是DNA降解会显现弥散带型。六、分析讨论 CTAB法提取基因组DNA的原理是什么？实验八-酵母的转化与挑选（4个学时）-基因组DNA的大样酶切一、实验目的：通过本实验学习酶切基因组DNA的方式和实验技术。二、实验原理在做

20、Southern杂交之前，基因组DNA的酶切是相当重要的一个环节。其中DNA样品的质量、纯度和限制性内切酶的选择将直接阻碍酶切成效。EcoRI是资料报导中在Southern-blotting中最为经常使用的一种酶，酶比较稳固、受抑制剂阻碍较轻，而且比较廉价。三、仪器、材料、试剂（一）仪器 恒温水浴锅，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪（二）材料 基因组DNA（上周提取），离心管，枪头等。（三）试剂 一、EcoRI酶； 二、Loading buffer3、琼脂糖四、实验步骤一、 酶切体系（总20 L）：混样进程应在冰上操作 10 H buffer： 2 L EcoRI：10-15 U （1 L

21、） 基因组DNA： 5-8 L ddH2O： 9-12 L Total： 20 L二、反映条件：37 反映 3 h；3、酶切反映的终止：加入2 L 10 Loading buffer4、凝胶电泳检测：低电压、长时刻跑。五、实验结果DNA被切成Smear的带型。六、关键知识点一、Takara酶切中常见的Buffer及其组成：（1）10 L 100 mM Tris-HCl100 mM MgCl210 mM Dithiothreitol（DTT，二硫苏糖醇）（2）10 M 100 mM Tris-Hcl100 mM MgCl210 mM Dithiothreitol500 mM NaCl（3）10

22、H 500 mM Tris-HCl100 mM MgCl210 mM Dithiothreitol1000 mM NaCl（4）10 K 200 mM Tris-HCl100 mM MgCl210 mM Dithiothreitol1000 mM KCl（5）10 T 330 mM Tris-acetate(pH 100 mM Mg-acetate5 mM Dithiothreitol660 mM K-acetate （6）10 loading buffer 组成SDS %Glycerol 50%Bromophenol Blue % 二、Southern-blotting的步骤： 基因组DNA

23、的提取大样酶切低电压长时刻的电泳（30V，一样留宿）转膜杂交放射自显影。七、分析讨论 基因组的酶切与质粒DNA的酶切有什么异同点？实验九-报告基因的表达检测（4个学时）-PBS提取植物总蛋白一、实验目的：通过本实验学习PBS提取植物总蛋白和利用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白的方式和实验技术。二、实验原理在做Nornthern杂交之前，总蛋白的提取和纯化是相当重要的一个环节。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各类蛋白质的溶解度不同，因此可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方式称之为盐析。盐浓度通经常使用饱和度来表示

24、。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。三、仪器、材料、试剂（一）仪器 制冰机，离心机（二）材料 幼嫩烟草叶片，离心管，枪头等。（三）试剂PBS Buffer；饱和硫酸铵溶液四、实验步骤一、将叶片剪碎后加入2-3 mL PBS缓冲液，充分研磨样品；二、将研磨成匀浆的样品转移至 mL的离心管中（每管750 L），冰上放置60 min；期间倒置混匀，以便蛋白质充分溶解；3、12000 rpm离心15 min；4、将上清转移至新管中；五、若是上清中仍有杂质，12000 g离心15 min；（假设没有杂质，此步骤能够省略）六、取上清液，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，现在能够看到白色

25、的蛋白质析出，倒置混匀15-30 min；（请注意：保留1管不加硫酸铵缓冲液的上清液，直接放在冰箱中备用）7、12000 rpm离心15 min；八、-20 保留备用。五、实验结果能够看到白色的蛋白质沉淀。六、分析讨论 硫酸铵能够沉淀蛋白质的原理是什么？实验十 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测一、实验目的：把握蛋白质凝胶电泳技术（SDS-PAGE）。二、实验原理 SDS是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部份定量结合，把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷不同，因此SDS-PAGE排除电荷效应，只有分子筛效应。在电场下，蛋白质分子依照分

26、子量大小在板状胶上排列。三、仪器、材料、试剂（一）仪器 玻璃板、胶条、梳子、垂直板电泳槽、电泳仪等。（二）材料 上周提取的蛋白质溶液（三）试剂 1、30丙烯酰胺 2、 mol/LTris（） 3、10SDS 4、10过硫酸铵 5、5 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 6、考马斯亮蓝染色液 7、考马斯亮蓝脱色液依照如下表格配制SDS-PAGE的分离胶(也称上层胶)：成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶51015203050蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)1M Tris,10%SDS10%过硫酸铵依照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶

27、)：成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%胶2346810蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)1M Tris,10%SDS10%过硫酸铵TEMED四、实验步骤1、 向15 L蛋白质上清中加入5 L 10 SDS-Loading Buffer，在滚水中煮沸3 min；2、12,000 g离心10 min，取上清， 点样（20 L）于已配制好的SDS-PAGE凝胶点样孔中；3、浓缩胶70 V电泳20-30 min（20 min），分离胶120 V电泳 h （ h）；4、用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色1 h以上；5、移出并回收染液，将凝胶浸于脱色液中，平缓摇动1-2 h，其间改换脱色液二到三次，直至看到蛋白质条带；6、脱色完毕后观看结果并拍照保留。五、实验结果 电泳终止后能看到不同大小的蛋白质条带。六、分析讨论SDS-PAGE能依照蛋白质分子量大小对其进行分离的原理是什么？