分子生物学实验.docx

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分子生物学实验

实验一感受态细胞制备（4学时）

一、实验目的：

通过本实验，把握大肠杆菌感受态细胞制备的方式和技术。

二、实验原理：

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称感受态。

其原理是细菌处于0℃、CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器：

1.超净工作台2.离心机3.恒温摇床4.高压灭菌锅5.移液枪6.振荡器

7.天平8.恒温水浴9.离心管10.锥形瓶

（二）材料：

大肠杆菌DH5α

（三）试剂：

1.lCaCl2溶液2.LB液体培育基%酒精

四、实验步骤

1.从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于3mlLB液体培育基的试管中，37℃震荡培育留宿。

2.取1ml菌夜转接到一个含有50mlLB液体培育基的锥形瓶中，37℃震荡培育2-3h（现在，A600应在之间，细胞数务必﹤108/ml，此为实验成功的关键）。

3.用移液枪取2ml菌液转移到离心管中，冰上放置10min。

（1000µl的枪，蓝色枪头，旋转不要太快，不能超过量程，每组至少做6管）

4.离心10min（4000r/min）。

（离心机，严禁空转和不平稳，利用之前用太平平稳，对称放。

上离心机之前，用卫生纸擦离心管。

不要贴标签。

用记号笔标记就能够够。

盖紧离心管口。

盖好离心机内盖）

5.倒出培育液，将管倒置1min，以使培育液流尽。

（在超净工作台中操作）

6.用冰凉的lCaCl2200µl悬浮沉淀（用振荡器），当即放在冰上保温30min。

（200µl的枪，黄色枪头）

7.低温离心10min（4000r/min），回收细胞。

8.用冰凉的lCaCl2200µl悬浮细胞（用振荡器）。

9.分装细胞，毎200ul一份，此细胞为感受态细胞。

五、实验结果：

有白色细胞细胞沉淀显现，该白色沉淀即为大肠杆菌感受态细胞。

六、分析讨论：

1.什么缘故实验步骤中A600应在之间，细胞数务必﹤108/ml？

2.步骤6和8中都加入了CaCl2目的一样吗？

它们的作用别离是什么？

3.本实验的注意事项有哪些？

实验二阳性克隆的挑选与鉴定、质粒DNA的提取（5学时）

一、实验目的：

通过本实验学习和把握碱裂解法提取质粒的技术和克隆载体的挑选与鉴定方式。

二、实验原理：

一、蓝白斑挑选原理

二、碱裂解法提取质粒是依照共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的不同而达到分离目的。

三、仪器、材料、试剂

（一）仪器：

一、恒温摇床二、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器

（二）材料：

一、含PUC-18质粒的大肠杆菌二、乙二胺四乙酸（EDTA）

3、三羟甲基氨基甲烷（Tris）4.葡萄糖5.氢氧化钠（NaOH）6.十二烷基硫酸钠（SDS）7、乙酸钾（KAc）八、冰醋酸（HAc）九、盐酸（HCl）10、Tris饱和酚1一、氯仿1二、异戊醇13、乙醇14、胰RNA酶1五、羧苄青霉素

1六、离心管

（三）试剂：

一、溶液І二、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液

五、LEDTA六、氯仿:

异戊醇（V:

V=24:

1）7、Tris饱和酚:

氯仿:

异戊醇（V:

V:

V=25:

24:

1）八、70%乙醇九、胰RNA酶

四、实验步骤

一、先在3mLLB液体培育基中加入3uL羧苄青霉素（终浓度50ug/mL），然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落，37℃震荡培育留宿。

二、取留宿培育的菌液2mL加入离心管中，4000r/min，倒出培育液，将所有菌体细胞搜集在离心管中。

（每组至少做6管）

3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的离心管中，旋涡震荡将细菌沉淀悬浮，室温放置10min。

4、加入200µl溶液Ⅱ（新鲜配置），轻轻混匀内容物，溶液慢慢变清亮后加入溶液Ш（万万不可用旋涡震荡器，裂解时刻不超过5min）。

5、加入150µl溶液Ш（冰上预冷），盖紧管口，轻轻混匀数次。

冰上放置15min让质粒DNA复性（万万不可用旋涡震荡器）。

6、12000r/min离心10min，将上清转至另一个离心管中。

（注意用枪取，记着取多少）

7、向上清中加入等体积饱和酚：

氯仿：

异戊醇溶液，旋涡混匀，12000r/min离心5min，将上清转至另一离心管中。

8、向上清中加入等体积氯仿：

异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，将上清转移到另一个离心管中。

9、向上清中加入2倍体积无水乙醇，旋涡混匀后，室温放置30min。

12000r/min离心10min，吸去上清液。

10、用200µl70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀1次（12000r/min离心5min），倒去上清液，空气中干燥。

1一、加入20uLRTE，使质粒DNA完全溶解。

五、实验结果

有白色质粒沉淀，然后又溶解。

六、分析讨论

1、溶液І、溶液Ⅱ、溶液Ш的作用别离是什么?

2、什么缘故真核生物基因组DNA不能用碱裂解法提取?

3、本实验需要把握哪些知识和技术？

实验三目标基因的5’-结尾的PCR扩增、3’-结尾的PCR扩增

一、实验目的：

学习和把握用RACE方式扩增cDNA的5’-结尾和3’-结尾的方式和技术。

二、实验原理：

一、聚合酶链反映的原理：

类似于DNA的天然复制进程。

包括高温变性（94oC）、低温退火（50o-60oC）、中温延伸（72oC）三个时期。

二、电泳技术原理：

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

分子量（片段）越小，其在电泳中跑的越快；构型越稳固，跑的越快。

三、仪器、材料、试剂：

热循环仪2.琼脂糖凝胶电泳系统3.紫外透射仪管、移液枪

模板混合物7.引物对（正向引物和反向引物）酶

9.琼脂糖10.×TBE11.10×PCRbuffer12.loadingbuffer

四、实验步骤：

1.依照模板，设计引物。

2.在PCR管内配制100µl反映体系。

双蒸水70μl

10×PCRbuffer10μl

mmol/LdNTP混合物8μl

正向引物4μl

反向引物4μl

模板DNA2μl

Taq聚合酶2μl

3.依照条件，设计PCR程序，进行扩增

94oC预变性2min

94oC变性30s

55oC退火30s

72oC延伸1min

重复步骤

（2）、（3）、（4）30次

72oC总延伸2min

4.琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

①将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，并架好样品梳子。

②制胶：

配制适宜浓度的琼脂糖凝胶。

准确称量g琼脂糖干粉，放入洗好的锥形瓶内，加入15ml倍的TBE（用量筒量取）。

然后，用纸盖着锥形瓶的口，放入微波炉内加热熔化，然后冷却片刻，加入1µl染色剂，混匀，然后倒入架好的有机玻璃内槽内中，待其凝固。

（先熔化30s，然后摇匀，再熔化。

倒的时候若是有气泡，用枪头处置）

③拔梳子：

室温下20-30min后，有机玻璃内槽的凝胶形成一层均匀的胶面，警惕拔出梳子。

④将有机玻璃内槽连同凝胶掏出，放入电泳槽内。

向电泳槽内加入电泳缓冲液（倍的TBE），其量以没过胶面1mm为宜（约42ml，量筒取）。

⑤加样：

别离取20µlDNA和20µlLoading-buffer混匀，用移液枪将混匀的样品缓缓加入点样孔中。

（每组点样5-6个孔）

⑥接通电源，红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极向正极移动，一样选择80V电压，电泳时刻为30min。

⑦当溴酚蓝移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。

⑧电泳完毕，关上电源，掏出凝胶，在染色室紫外透射仪下观看结果。

（注意要带上手套，不要把有机玻璃内槽拿到染色室）

五、实验结果：

基因存在处显示出绿色荧光条带。

六、分析讨论：

1.PCR技术的原理？

2.RACE技术的原理？

实验四目标产物的回收与纯化（4学时）

一、实验目的：

学习和把握回收纯化DNA的方式和技术。

二、实验原理：

采纳平稳酚抽提，无水乙醇和醋酸钠沉淀法，回收纯化DNA。

三、仪器、材料和试剂

（一）仪器：

1.离心机2.琼脂糖凝胶电泳系统3.紫外透射仪4.移液枪

（二）材料：

PCR产物

（三）试剂：

饱和酚:

氯仿:

异戊醇（V:

V:

V=25:

24:

1）

2.氯仿:

异戊醇（V:

V=24:

1）

醋酸钠（

4.无水乙醇

%酒精

缓冲液

四、实验步骤

µlPCR产物补水至200µl，加等体积（200µl）的Tris饱和酚:

氯仿:

异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，取上清（约120µl）。

2.加等体积氯仿:

异戊醇，旋涡混匀，12000r/min离心5min，取上清（约100µl）。

3.加等体积无水乙醇（冰上预冷）和1/10体积3M醋酸钠（，充分混匀（漩涡混匀或用手摇200次），沉淀DNA。

4.手动短时离心3-5s，冰上沉淀30min。

min离心10min，弃上清。

6.用200µl70%乙醇洗涤沉淀1次（12000r/min离心5min），弃上清，空气中干燥。

7.加入20µlTE，溶解。

8.电泳检测。

五、实验结果

基因存在处显示绿色荧光条带。

六、分析讨论

1.如何纯化PCR产物或粗提的DNA？

实验五PCR产物与载体的连接、连接产物的转化（5学时）

一、实验目的：

学习和把握DNA重组和重组子鉴定的方式。

二、实验原理：

酶切—连接—转化—蓝白斑挑选。

三、实验仪器、材料和试剂：

1、恒温摇床二、离心机3、超净工作台4、恒温水浴

五、移液枪六、LB液体培育基7、LB固体培育基

八、IPTG九、X-gal10、质粒1一、感受态细胞1二、酶切分子试剂EcorI

13、solutionI（含目的基因和连接酶）

四、实验步骤

（一）质粒DNA的制备

（二）目的基因的取得（solutionI含目的基因和连接酶）

（三）质粒DNA酶切

1.别离取两管酶切反映体系：

5μl质粒+5ulEcorI酶+5μl酶切反映液+5μl无菌水。

2.短时离心混匀（10S之内）。

3.37℃保温1h。

（四）载体和目的基因的连接

1.取两管10μl反映体系：

5μl酶切产物+5μlSolution

，混匀，16℃水浴1h。

（五）连接产物的转化

1.取感受态细胞200μl，加入10μl连接产物，冰浴30min。

2.热激：

42℃保温90s。

3.冰浴2min。

4.加入800μlLB液体培育基，37℃慢摇苏醒30min，同时在超净工作台上制作选择平板。

（六）重组子的鉴定（蓝白斑挑选）

1.将苏醒菌液4000r/min离心1min，先吸去800μl上清液，再将细胞吹散成细胞悬液，取50μl细胞悬液直接涂布在含有羧苄青霉素、X-gal、IPTG的选择平板上。

2.将平板（培育皿）正向放置30min至液体被吸收，倒置平皿37℃培育16h，显现菌落，其中白色菌落为重组质粒。

五、实验结果：

显现的白色菌落为含有重组质粒的大肠杆菌菌落。

六、分析讨论：

1.蓝白斑挑选的原理？

实验六克隆片段的鉴定（5学时）

一、实验目的：

学习和把握重组克隆的鉴定方式。

二、实验原理：

克隆位点双侧别离有EcoRI和HindIII酶切位点，因此这两种酶能够将插入片段从克隆载体中切割下来。

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，能够观看插入片段的大小。

三、仪器、材料、试剂

1.实验仪器

离心机、移液枪；制冰机；电泳仪；紫外透射仪。

2.材料

质粒载体。

3.试剂

限制性内切酶EcoRI和HindIII。

四、实验步骤

1.挑取生长较好的单菌落，导入装有2mlLB液体培育基的离心管中，在恒温摇床培育1h。

（37℃，200转）

2.提取质粒。

3.用EcoRI和HindIII内切酶双酶切插入有外源片段的质粒载体，按以下体系配置反映液：

双酶切反映体系（50μl）

反应成分reactioningredient体积volume

10×HBuffer10μl

质粒DNA20μl

EcoRI酶5μl

HindIII酶5μl

ddH2O10μl

4.混匀后，手动离心3-5s，置37℃反映1h，反映终止后，电泳检测。

五、实验结果：

基因存在处显示两条绿色荧光条带。

六、分析讨论

1.进行双酶切反映注意哪些问题？

实验七-酵母表达载体的构建（11个学时）

CTAB法提取植物基因组DNA

一、实验目的：

通过本实验学习从植物基因组中提取DNA的方式和实验技术。

二、实验原理

CTAB在高离子强度的溶液中（>mol/LNaCl）与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

EDTA抑制DNA酶的活性。

再用氯仿/异戊醇抽提的方式去除蛋白质，取得的DNA溶液经NaAC和异丙醇沉淀。

三、仪器、材料、试剂

（一）仪器

恒温水浴锅，离心机，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪

（二）材料

幼嫩的烟草叶片，CTAB，EDTA，NaCl，Tris，2mL离心管，枪头等。

（三）试剂

1、CTAB缓冲液；

2、3MNaAc；

3、氯仿/异丙醇=24;1；

4、70%酒精。

四、实验步骤

1、CTAB缓冲液置于65℃水浴锅中温浴1h；

2、取幼嫩的烟草叶片置于研钵中，加入2mLCTAB缓冲液充分研磨；

3、将研磨后的匀浆别离装在离心管中（注意每一个离心管中只装1mL的匀浆），65℃水浴1h，中间倒置混匀4-5次；

4、加入等体积的氯仿/异戊醇（24：

1），倒置混匀5min；

3、12000rpm离心15min；

4、取上层液体，加入80μl3MNaAc和800μl异丙醇，倒置混匀后室温静置15min；

5、12000rpm离心15min；

6、弃上清，加入500μl70%酒精洗沉淀一次；

7、12000rpm离心5min；

8、弃上清，沉淀在室温下干燥20-30min后加入30μlddH2O溶解DNA。

9、取3-5μl新提取的DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，其余的样品保留在-20℃冰箱中备用。

五、实验结果

提取取得的DNA应为一条带，若是DNA降解会显现弥散带型。

六、分析讨论

CTAB法提取基因组DNA的原理是什么？

实验八-酵母的转化与挑选（4个学时）

-基因组DNA的大样酶切

一、实验目的：

通过本实验学习酶切基因组DNA的方式和实验技术。

二、实验原理

在做Southern杂交之前，基因组DNA的酶切是相当重要的一个环节。

其中DNA样品的质量、纯度和限制性内切酶的选择将直接阻碍酶切成效。

EcoRI是资料报导中在Southern-blotting中最为经常使用的一种酶，酶比较稳固、受抑制剂阻碍较轻，而且比较廉价。

三、仪器、材料、试剂

（一）仪器

恒温水浴锅，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统，凝胶成像仪

（二）材料

基因组DNA（上周提取），离心管，枪头等。

（三）试剂

一、EcoRI酶；

二、Loadingbuffer

3、琼脂糖

四、实验步骤

一、酶切体系（总20μL）：

混样进程应在冰上操作

10×Hbuffer：

2μL

EcoRI：

10-15U（1μL）

基因组DNA：

5-8μL

ddH2O：

9-12μL

Total：

20μL

二、反映条件：

37℃反映3h；

3、酶切反映的终止：

加入2μL10×Loadingbuffer

4、凝胶电泳检测：

低电压、长时刻跑。

五、实验结果

DNA被切成Smear的带型。

六、关键知识点

一、Takara酶切中常见的Buffer及其组成：

（1）10×L

100mMTris-HCl

100mMMgCl2

10mMDithiothreitol（DTT，二硫苏糖醇）

（2）10×M

100mMTris-Hcl

100mMMgCl2

10mMDithiothreitol

500mMNaCl

（3）10×H

500mMTris-HCl

100mMMgCl2

10mMDithiothreitol

1000mMNaCl

（4）10×K

200mMTris-HCl

100mMMgCl2

10mMDithiothreitol

1000mMKCl

（5）10×T

330mMTris-acetate（pH

100mMMg-acetate

5mMDithiothreitol

660mMK-acetate

（6）10×loadingbuffer组成

SDS%

Glycerol50%

BromophenolBlue%

二、Southern-blotting的步骤：

基因组DNA的提取—大样酶切—低电压长时刻的电泳（30V，一样留宿）—转膜—杂交—放射自显影。

七、分析讨论

基因组的酶切与质粒DNA的酶切有什么异同点？

实验九-报告基因的表达检测（4个学时）

-PBS提取植物总蛋白

一、实验目的：

通过本实验学习PBS提取植物总蛋白和利用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白的方式和实验技术。

二、实验原理

在做Nornthern杂交之前，总蛋白的提取和纯化是相当重要的一个环节。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各类蛋白质的溶解度不同，因此可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方式称之为盐析。

盐浓度通经常使用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

三、仪器、材料、试剂

（一）仪器

制冰机，离心机

（二）材料

幼嫩烟草叶片，离心管，枪头等。

（三）试剂

PBSBuffer；饱和硫酸铵溶液

四、实验步骤

一、将叶片剪碎后加入2-3mLPBS缓冲液，充分研磨样品；

二、将研磨成匀浆的样品转移至mL的离心管中（每管750μL），冰上放置60min；期间倒置混匀，以便蛋白质充分溶解；

3、12000rpm离心15min；

4、将上清转移至新管中；

五、若是上清中仍有杂质，12000g离心15min；（假设没有杂质，此步骤能够省略）

六、取上清液，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，现在能够看到白色的蛋白质析出，倒置混匀15-30min；（请注意：

保留1管不加硫酸铵缓冲液的上清液，直接放在冰箱中备用）

7、12000rpm离心15min；

八、-20℃保留备用。

五、实验结果

能够看到白色的蛋白质沉淀。

六、分析讨论

硫酸铵能够沉淀蛋白质的原理是什么？

实验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测

一、实验目的：

把握蛋白质凝胶电泳技术（SDS-PAGE）。

二、实验原理

SDS是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部份定量结合，把大多数蛋白质拆成亚单位，并带上阴离子。

这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷不同，因此SDS-PAGE排除电荷效应，只有分子筛效应。

在电场下，蛋白质分子依照分子量大小在板状胶上排列。

三、仪器、材料、试剂

（一）仪器

玻璃板、胶条、梳子、垂直板电泳槽、电泳仪等。

（二）材料

上周提取的蛋白质溶液

（三）试剂

1、30％丙烯酰胺2、mol/LTris（）3、10％SDS4、10％过硫酸铵

5、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液6、考马斯亮蓝染色液7、考马斯亮蓝脱色液

依照如下表格配制SDS-PAGE的分离胶（也称上层胶）：

成分

配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）

10%胶

5

10

15

20

30

50

蒸馏水

30%Acr-Bis（29:

1）

1MTris,

10%SDS

10%过硫酸铵

依照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶（也称堆积胶、积层胶或上层胶）：

成分

配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）

5%胶

2

3

4

6

8

10

蒸馏水

30%Acr-Bis（29:

1）

1MTris,

10%SDS

10%过硫酸铵

TEMED

四、实验步骤

1、向15µL蛋白质上清中加入5µL10×SDS-LoadingBuffer，在滚水中煮沸3min；

2、12,000×g离心10min，取上清，点样（20µL）于已配制好的SDS-PAGE凝胶点样孔中；

3、浓缩胶70V电泳20-30min（20min），分离胶120V电泳h（h）；

4、用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色1h以上；

5、移出并回收染液，将凝胶浸于脱色液中，平缓摇动1-2h，其间改换脱色液二到三次，直至看到蛋白质条带；

6、脱色完毕后观看结果并拍照保留。

五、实验结果

电泳终止后能看到不同大小的蛋白质条带。

六、分析讨论

SDS-PAGE能依照蛋白质分子量大小对其进行分离的原理是什么？