双特异性抗体及其应用.docx

1、双特异性抗体及其应用双特异性抗体及其应用Gaowei Fan, Zujian Wang, Mingju Hao and Jinming Li摘要：双特异性抗体(BsAbs)可以识别两个不同的抗原表位。这种双重特性为其开辟了广阔的应用前景，包括招募T细胞重定向肿瘤细胞，同时阻断两个不同的信号通路，对不同疾病介质的双重锚定和传递特定药物到目标位点。catumaxomab(抗EpCAM和CD3)和blinatumomab(抗CD19和CD3)的获批成为bsAbs发展的一个重要里程碑。目前，已开发出超过60种不同的bsAb型式，其中部分已进入了临床实验。本文总结了不同的bsAbs型式及其临床应用，揭示

2、了优化设计bsAbs的策略。关键字：双特异性抗体，BiTE，癌症，型式，Catumaxomab，诊断缩写ADCC抗体依赖的细胞介导细胞毒性作用DNLdock-and-lockADCP抗体依赖的细胞吞噬作用IgG免疫球蛋白GALL淋巴细胞白血病mAb单克隆抗体BACE1-site APP-cleaving酶1MPM恶性胸膜间皮瘤BiTE双特异性T细胞衔接器NHL非霍奇金淋巴瘤BsAb双特异性抗体NSCLC非小细胞肺癌CDC补体依赖细胞毒性scFv单链FvDARTs双亲和重定向分子TandAbs串联双抗体Wet AMD湿型年龄相关性黄斑变性1 背景目前，有44个基于单克隆抗体(mAb)的产品在市上

3、销售，2013年全球销售总额大约为750亿美元1。治疗性抗体已经成为癌症、自身免疫、炎症和各种其他疾病患者的主要选择药物2，3。然而，单克隆抗体有几个局限性。病人接受mAb治疗可能产生耐药性或无应答4。癌症和其他疾病是多因素疾病，有多种信号通路参与疾病发生。单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。双特异性抗体(BsAbs) 作为潜在的癌症治疗药物已提出了几十年，但直到最近才开始结出果实。BsAbs有几个优势5:(1)bsAbs可以将特定的免疫细胞重定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，(2)bsAbs可以同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能(3)bsAbs与两种不同的细胞表面抗原

4、结合后，相对而言可能潜在的增加结合特异性。制造方面的问题一直以来困扰着BsAbs的开发，如产品不稳定、表达产量低、会产生免疫原性等6。新型式的bsAbs更稳定、更容易生产以及更少的免疫原性使BsAbs的开发已经成为了可能。目前，超过30个bsAbs处于临床开发阶段，更有两个先驱者已上市(表1)。表1 临床试验中的双特异性抗体 (https:/ clinicaltrials.gov)双抗类型靶点机理公司阶段适应症CatumaxomabTriomabEpCAM，CD3T细胞的招募，Fc介导效应器功能Neovii 欧盟批准EpCAM阳性肿瘤恶性腹水AGO Study Group完成II期，NCT00

5、189345铂难治性卵巢上皮癌AIO-Studien-gGmbHII期，NCT01504256胃腺癌Grupo Espaol de Investigacin en Cncer de OvarioII期，NCT01246440卵巢癌Gustave RoussyII期，NCT01784900胃腹膜癌扩散ErtumaxomabTriomabHER2，CD3T细胞的招募，Fc介导效应器功能Krankenhaus NordwestI/II期，NCT01569412Her2 / Neu阳性晚期实体瘤FBTA05TrioMabCD20，CD3T细胞招募慕尼黑技术大学I/II期，NCT01138579白血病B

6、linatumomabBiTECD3，CD19T细胞招募安进(慕尼黑) 美国批准淋巴细胞白血病I期，NCT00274742复发非霍奇金淋巴瘤II期，NCT01207388B细胞淋巴细胞白血病II期，NCT01209286复发/难治性淋巴细胞白血病National Cancer InstituteII期，NCT02568553非霍奇金淋巴瘤II期，NCT02143414成人b淋巴细胞白血病t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1;未经治疗的成人淋巴细胞白血病III期，NCT02003222BCR-ABL阴性B淋巴细胞白血病Solitomab(MT110，AMG 110)BiTEC

7、D3，EpCAMT细胞招募安进(慕尼黑) I期完成，NCT00635596实体肿瘤AMG 330BiTECD33，CD3T细胞招聘安进I期，NCT02520427复发/难治性非霍奇金淋巴瘤MT112(BAY2010112)BiTEPSMA， CD3T细胞招聘拜耳I期，NCT01723475前列腺肿瘤MT111(MEDI- 565)BiTECEA，CD3T细胞招聘MedImmune LLCI期完成，NCT01284231胃肠道腺癌BAY2010112BiTECD3，PSMAT细胞招聘拜耳I期，NCT01723475前列腺肿瘤MDX4472(Fab)交联CD64,EGFR激活单核细胞杀死肿瘤Dar

8、tmouth-Hitchcock医疗中心I期完成，NCT00005813大脑和中枢神经系统肿瘤TF2Dock and lockCEA,HSG 酶联免疫吸附检测新泽西州癌症中心分子医学和免疫中心I期，NCT00895323结肠直肠癌放射免疫疗法Centre Ren GauducheauI / II期，NCT01221675小细胞肺癌Immuno-PET南特大学医院I / II期，NCT01730638复发甲状腺髓样癌Immuno-PET南特大学医院I / II期，NCT01730612HER2阴性乳腺癌表达CEA放射免疫疗法内梅亨大学I期完成，NCT00860860结直肠肿瘤rM28串联scFv

9、CD28，HMV-MAA自体淋巴细胞重靶向肿瘤图宾根大学医院I / II期，NCT00204594恶性黑色素瘤HER2Bi-aATCT细胞预装bsAbsCD3，HER2激活T细胞Barbara Ann Karmanos CancerInstituteI期，NCT02470559卵巢、输卵管或原发性腹膜癌GD2Bi-aATC1877509T细胞预装bsAbsCD3，GD2激活T细胞Barbara Ann Karmanos CancerInstituteI / II期，NCT02173093儿童和年轻人神经母细胞瘤和骨肉瘤I期完成，NCT00938626多发性骨髓瘤和浆细胞肿瘤I期完成，NCT00

10、244946非霍奇金淋巴瘤EGFRBi-aATCT细胞预装bsAbsCD3，EGFR自体激活T细胞EGFR阳性肿瘤Barbara Ann Karmanos CancerInstituteI / II期，NCT02521090成年人大脑胶质母细胞瘤;复发成人脑神经胶质瘤MGD006DARTCD123，CD3T细胞重靶向肿瘤MacroGenicsI期，NCT02152956复发/难治性急性髓细胞白血病（AML）MGD007DARTgpA33，CD3T细胞重靶向肿瘤MacroGenicsI期，NCT02248805结直肠癌MGD010DARTCD32B，CD79BMacroGenicsI期，NCT0

11、2376036健康受试者Anti-CEAanti-DTPAscFv-IgGCEA，di -DTPA- 131I放射免疫疗法南特大学医院II期完成，NCT00467506甲状腺髓样癌DT2219ARL2 scFv偶联白喉毒素CD19，CD22蛋白毒素靶向肿瘤共济会癌症中心I期，NCT00889408白血病，淋巴瘤I / II期，NCT02370160复发或难治性B系白血病或淋巴瘤IMCgp100ImmTACCD3，gp100T细胞招募Immunocore I期，NCT01211262恶性黑色素瘤I期，NCT02570308葡萄膜黑色素瘤Indium-labeled IMP - 205 xm734

12、不清楚CEA，内标记肽核成像内梅亨大学I期，NCT0018508结肠直肠癌LY3164530OrthoFab-IgGMET，EGFR阻断2个受体礼来I期，NCT02221882肿瘤;肿瘤转移OMP- 305883DVD-IgDLL4，VEGF2配体失活OncoMedI期，NCT02298387晚期固体恶性肿瘤REGN1979不清楚CD20，CD3T细胞招募Regeneron制药I期，NCT02290951CD20 阳性B细胞恶性肿瘤COVA322IgG-fynomerTNF-，IL17A两种炎症因子阻断CovagenI / II期，NCT02243787斑块性银屑病RG7802CrossMab

13、CEA，CD3T细胞招聘罗氏公司I期，NCT02324257固体肿瘤RG7813(RO6895882)ScFv-IgGCEA，IL2的细胞因子罗氏公司I期，NCT02004106晚期和/或转移性固体CEA阳性肿瘤RG7221(RO5520985)CrossMAbAng-2，VEGF2配体失活罗氏公司II期，NCT01688206肿瘤RG7716CrossMAbVEGF，Ang-22配体失活罗氏公司II期，NCT02484690湿性AMDMM - 111HAS bodyHER2， HER3阻断两个受体梅里马克制药I期完成，NCT01097460乳腺肿瘤I期完成，NCT00911898her2扩增

14、实体肿瘤MM - 141scFv-IgGIGF-IR，HER3阻断两个受体梅里马克制药I期，NCT01733004肝细胞癌II期，NCT02399137胰腺癌MOR209 / ES414scFv-IgGPSMA， CD3T细胞招募紧急产品开发西雅图LLCI期，NCT02262910前列腺癌TargomiRs不清楚EGFR，EDV传递纳米粒子悉尼大学I期，NCT02369198反复恶性胸膜间皮瘤（MPM）和非小细胞肺癌MSB0010841NanobodyIL-17A / F阻断2炎症因子德国默克制药公司I期，NCT02156466牛皮癣alx - 0061NanobodyIL-6R，HSA阻断炎

15、症因子，结合HSA增加半衰期AblynxI / II期完成，NCT01284569类风湿性关节炎Ozoralizumab(atn - 103)NanobodyTNF，HSA阻断炎症因子，结合HSA增加半衰期AblynxII期完成，NCT01063803类风湿性关节炎AFM13TandAbCD30，CD16A激活NK细胞科隆大学II期，NCT02321592复发或难治性霍奇金淋巴瘤AFM11TandAbCD30，CD19重定向的T细胞Affimed GmbHI期，NCT02106091复发和/或耐火CD19阳性 B细胞非霍奇金淋巴瘤SAR156597scFv-IgGIL4，IL13阻断炎症因子赛

16、诺菲安万特I / II期完成，NCT01529853突发性肺纤维化II期，NCT02345070突发性肺纤维化BsAbs主要是由三种方法制成7：(1)细胞杂交瘤技术是基于两种不同的杂交瘤细胞系的细胞融合，(2)化学结合，包括化学交联，(3)利用DNA重组技术的遗传学方法。这些技术革新了bsAbs的开发，满足特定应用的各种类型BsAbs被开发出来，其中部分在本文中进行了讨论。2 BsAb类型BsAbs大致可以分为两类：免疫球蛋白G(IgG)样分子和非IgG样分子(图1)。IgG样BsAbs保留F介导效应功能，如抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)、补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞吞噬作用

17、(ADCP)6。BsAbs的Fc区域使纯化变得容易，同时提高了抗体的溶解性和稳定性。IgG样类型的BsAbs由于他们分子结构较大以及FcRn介导的回收作用，因而具有更长的半衰期8。非IgG样BsAbs由于分子结构较小，使其获得了更强的组织渗透力8。图1 双特异性抗体分子类型2.1 IgG样类型2.1.1 杂交瘤细胞杂交瘤细胞技术依赖于融合两个截然不同的杂交瘤细胞。Ig的重链和轻链随机配对就产生了bsAbs9。在这个过程中，同时也生成了非功能性抗体。采用杂交瘤细胞技术生产的BsAbs与传统的抗体相似。Catumaxomab，第一个获批的bsAb，就是由老鼠/小鼠杂交瘤细胞系生产的。2.1.2 K

18、nobs-into-holes生产带Fc片段的bsAbs会带来一些挑战，如生成不希望出现的同型二聚体或其他一些错配的杂质分子。“knobs-into-holes”方法通过在一个抗体的CH3区域用大分子氨基酸替换掉小分子氨基酸形成“knob”，同时在另一个抗体中采用相反的方式处理形成“hole”，二者结合后形成杂合抗体，采用此方法就可以解决Fc部分错配问题10。从理论上讲，任何两个不同的抗体都可以采用“knobs-into-holes”方法形成异型二聚体。然而，“轻链错配”又带来了另一个挑战。为了避免这个问题，人们又提出了几种解决方法：A）采用共有轻链生成bsAbs 11。然而，在这个策略中，结

19、合特异性受限制且不是对所有bsAbs都适用。B）在不同的菌体中分别表达一半的“knob”和“hole”。这种方法可以避免轻链错配。然而，在细菌细胞中表达会导致失去关键的糖基化修饰，这可能影响抗体效应器功能（如抗体依赖细胞毒性由糖基与Fc受体结合后诱导产生）12。C）结合CrossMab和knobs-into-holes策略来将错配减到最低程度。在CrossMab抗体中，将重链的CH1结构域与轻链相应的CL结构域进行交换，以促使轻链正确配对13。采用knobs-into-holes和CrossMab策略，罗氏制成了针对Ang-2和VEGFA的双特异抗体A2V CrossMab14。D) 在VH-

20、VL和CH1-CL之间引入额外的突变。这些突变促使重链优先与轻链结合15。该方法的一个缺点是，它需要在抗体保守区进行大范围的突变。2.1.3 双可变结构域Ig(Dual-variable domains Ig, DVD-Ig)两个单克隆抗体的可变区采用串联的方式融合在一起形成一个双特异性IgG样分子16。DVD-Ig的每个Fab都能与两个靶点结合。从理论上讲，任何一对单克隆抗体都可以用于制成一个DVD-Ig分子。由此产生的特定抗体可以进一步修饰以改变其结合价和特异性。该技术避免了不同重链和轻链间的错配，同时也能提高产品的产量、均一性和稳定性。此外，Fc区还有利于纯化。然而，有一个潜在的风险，靠

21、里面的可变区亲和力可能会变弱17。2.1.4 IgG-单链抗体(IgG -scFv)将一个单链抗体或单独一个可变区结构融合到轻链或重链的末端形成IgG-scFv。这种类型的抗体也包含在DVD-Igs内。2.1.5 二合一（two-in-one）或双功能Fab（DAF）抗体DAF抗体的抗原结合位点能够识别双抗原18。为了达到这个目标，首先需要确定一个能结合目标抗原的模板抗体。然后通过对抗原结合位点进行突变以识别第二抗原。接下来的工作是进一步抗原结合位点的双亲和力。然而，二合一抗体也不能同时结合两种不同的抗原（抗原表位）。2.1.6 半分子交换（Half-molecule exchange）人类血

22、清中，IgG4可以进行半分子交换，这促使了可称为“半分子交换”的IgG4 bsAbs构建策略的诞生。在IgG1 CH3部位引入点突变后，IgG1抗体可以在可控的条件下进行半分子交换而形成bsAbs19。这种策略也适用于人类的IgG2和IgG3。这种方法的最重要的优点是可以先分别表达亲代IgGs，然后通过调控形成不同的子代bsAbs。因此，该方法可以简便的在短期内制备大量bsAbs。此外，采用半分子交换形成的bsAbs保持了抗体的天然结构，免疫原性低。2.1.7 -抗体一条重链和两条具有不同结合特异性的轻链(和)可以在一个细胞中进行共表达。这样，可以在同一个重链上结合和轻链，从而制成bsAbs2

23、0，然后由高度选择性亲和树脂纯化。-抗体的优点是显而易见的：首先，bsAbs未经修饰，保留完整的人IgG型式；其次，bsAbs可以很容易的从抗体混合物中纯化出来；第三，bsAbs可以以工业规模生产；最后，纯化平台可以应用于所有-body，从而可以并行开发不同的bsAbs20。2.2 非IgG样类型2.2.1 基于单链抗体的bsAbs （scFv-based bsAbs）单链抗体仅由用于结合抗原的VL和VH两部分组成。通过修改链接区长度、抗体序列和外部因素，ScFvs可被制成二聚体、三或四聚体21。与正常IgG分子相比，scFvs具有更高的肿瘤特异性和组织渗透力；因此，基于单链抗体的 bsAbs

24、备受青睐，并有几个可能应用于临床。2.2.1.1 串联单链抗体两个单链抗体通过一个灵活的连接肽如甘氨酸-丝氨酸重复基序连接起来形成串联结构7。采用短连接肽可防止VH和VL结构域中出现链见配对。采用长连接肽则可使抗原结合位点能够自由旋转。著名的双特异性T细胞连接器(BiTE)技术就是基于这种格式的。2.2.1.2 双价抗体型式（Diabody）在双价抗体结构中，两个不同抗体的可变区分别由两个连接肽连接起来。第一个抗体的VH与第二个抗体的VL相连，同时第一个抗体的VL和第二个抗体的VH相连。两个连接肽增加了抗体的稳定性。然而，这两个连接肽也限制了抗原结合位点的移动性，从而限制了抗原的识别。2.2.

25、1.3 单链双价抗体双价抗体型式可以通过链间增加一段连接肽制成单链双价抗体。2.2.1.4 串联双价抗体(TandAbs)当两对VL和VH通过一个单链连接起来后，制成一个四价TendAb。2.2.1.5 双亲和重靶向分子（DARTs）DARTs是将第一个可变区的VH与第二条链的VL连接，同时将第二可变区的VH与第一条链的VL连接形成一个VLA-VHB+VLB-VHA型式的复合物22。链间引入二硫键来增加抗体的稳定性22。DARTs由于尺寸较小导致其容易被机体清除。为了避免这种情况，MacroGenics在DARTs上融合了一个Fc片段以延长其血清保留时间23。2.2.2 纳米抗体（Nanobo

26、dies）纳米抗体是天然形成的最小的抗体，它只有重链部分（15kDa)24。纳米抗体可以在缺少轻链的情况下与相应的抗原结合。来自美洲驼和骆驼的具有不同结合特异性的纳米抗体已经被短链连接起来形成bsAbs25。2.2.3 Dock-and-lock(DNL)方法将抗体片段与异型二聚化蛋白（如cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）和A激酶结合蛋白（AKAP）进行融合。当蛋白质形成异型二聚体后，就行成了双特异性抗体26。2.2.4 其它双特异性或多特异性分子ScFvs还可以连接到其他分子如细胞因子TNF-（天然的TNF-以三聚物的形式存在）、胶原蛋白XV或XVIII的三聚结构、拉链二聚作用域(Fos或Ju

27、n)来生成多价分子6。2.3 延长半衰期策略基于单链抗体的bsAbs有很多优势，比如易于制造，组织渗透力强，此外，他们还可以与完整抗体因空间位阻不能结合的抗原表位进行结合。进一步说，他们因缺少Fc区域而具有更低的免疫原性，从而避免被FcR所吸收。但是，基于单链抗体的bsAbs由于其半衰期短也导致了几个缺点，如血液清除快、fast offrates和针对靶点（如肿瘤）保留时间短。在临床应用中，血清半衰期短的药物需增加给药频率和量27。因此，延长血清半衰期在经济和治疗两方面都有益。有几种策略可以延长bsAbs的血清半衰期，如:2.3.1 聚乙二醇化附加高度灵活、亲水的分子如PEG可以增加bsAbs

28、的体积，从而提高他们的血清半衰期。然而，附加PEG的数量和尺寸链会导致抗体部分失活或亲和力降低28。定点结合一个单链PEG链的方式似乎是一个理想的策略27。2.3.2 与人血清白蛋白或半结合清蛋白融合将scFvs与HSA或半结合清蛋白融合可以延长其的血清半衰期。此外，HSA与FcRn相互作用不会改变抗原结合的亲和力。这种策略被抗体工程师广泛采用。抗体与白蛋白融合/结合后不仅增加了其分子的大小，还能促进bsAbs再利用，延长半衰期。白蛋白被细胞吸收后，会首先与早期内涵体上的FcRn结合，从而避免被破坏。然后，白蛋白被重新运送到细胞质膜并释放到血浆27。梅里马克公司（Merrimack）采用这个方

29、法成功开发出MM-111。Ozoralizumab(ATN-103，Ablynx)是一种来自于骆驼的重链制成的分子量为38kDa的三价双特异性纳米抗体。理论上，这样的小分子药物容易被肾脏清除。为了解决这个问题，ozoralizumab被设计成与HAS结合，保留了其结合TNF-29的特异性。2.3.3 与Fc片段融合一些抗体工程师将Fc片段与基于单链抗体的bsAbs融合。Fc的片段不仅提高了分子的大小，还能通过FcRn促进再利用。MacroGenics开发出Fc-bearing DART MGD007用于治疗结肠癌患者。2.3.4 多聚化多聚化是另一个通过调整大小和结合力来优化bsAb半衰期的策略。3 BsAbs的临床应用3.1 BsAbs重定向免疫效应细胞以缩短其与肿瘤细胞的距离细胞毒性T淋巴细胞在对抗癌症细胞的免疫反应中发挥着重要作用30。然而，在免疫反应过程中，肿瘤特异性T细胞反应往往受限于被肿瘤细胞利用的免疫逃逸机制。免疫疗法在过去几年中的进展已经可以克服这一挑战。一个利用免疫细胞的策略是利用bsAbs来杀死肿瘤细胞。几个正在进行临床实验的bsAbs被设计成将T细胞重定向至肿瘤细胞31。这个过程伴随着在T细胞和肿瘤细胞间形成临时的溶细胞突触。随后T细胞的激活和增殖导致肿瘤细胞被裂解32。除了T细胞，其他免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞