双特异性抗体及其应用.docx

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双特异性抗体及其应用

双特异性抗体及其应用

GaoweiFan,ZujianWang,MingjuHaoandJinmingLi

摘要：

双特异性抗体（BsAbs）可以识别两个不同的抗原表位。

这种双重特性为其开辟了广阔的应用前景，包括招募T细胞重定向肿瘤细胞，同时阻断两个不同的信号通路，对不同疾病介质的双重锚定和传递特定药物到目标位点。

catumaxomab（抗EpCAM和CD3）和blinatumomab（抗CD19和CD3）的获批成为bsAbs发展的一个重要里程碑。

目前，已开发出超过60种不同的bsAb型式，其中部分已进入了临床实验。

本文总结了不同的bsAbs型式及其临床应用，揭示了优化设计bsAbs的策略。

关键字：

双特异性抗体， BiTE， 癌症，型式， Catumaxomab，诊断

缩写

ADCC

抗体依赖的细胞介导细胞毒性作用

DNL

dock-and-lock

ADCP

抗体依赖的细胞吞噬作用

IgG

免疫球蛋白G

ALL

淋巴细胞白血病

mAb

单克隆抗体

BACE1

β-siteAPP-cleaving酶1

MPM

恶性胸膜间皮瘤

BiTE

双特异性T细胞衔接器

NHL

非霍奇金淋巴瘤

BsAb

双特异性抗体

NSCLC

非小细胞肺癌

CDC

补体依赖细胞毒性

scFv

单链Fv

DARTs

双亲和重定向分子

TandAbs

串联双抗体

WetAMD

湿型年龄相关性黄斑变性

1背景

目前，有44个基于单克隆抗体（mAb）的产品在市上销售，2013年全球销售总额大约为750亿美元[1]。

治疗性抗体已经成为癌症、自身免疫、炎症和各种其他疾病患者的主要选择药物[2， 3]。

然而，单克隆抗体有几个局限性。

病人接受mAb治疗可能产生耐药性或无应答[4]。

癌症和其他疾病是多因素疾病，有多种信号通路参与疾病发生。

单一靶点的免疫疗法似乎并不足以摧毁癌细胞。

双特异性抗体（BsAbs）作为潜在的癌症治疗药物已提出了几十年，但直到最近才开始结出果实。

BsAbs有几个优势[5]:

（1）bsAbs可以将特定的免疫细胞重定向至肿瘤细胞以增强对肿瘤的杀伤力，

（2）bsAbs可以同时阻断两种不同介质/通路而发挥独特的或重叠的功能（3）bsAbs与两种不同的细胞表面抗原结合后，相对而言可能潜在的增加结合特异性。

制造方面的问题一直以来困扰着BsAbs的开发，如产品不稳定、表达产量低、会产生免疫原性等[6]。

新型式的bsAbs更稳定、更容易生产以及更少的免疫原性使BsAbs的开发已经成为了可能。

目前，超过30个bsAbs处于临床开发阶段，更有两个先驱者已上市（表1）。

表1临床试验中的双特异性抗体（https:

//clinicaltrials.gov）

双抗

类型

靶点

机理

公司

阶段

适应症

Catumaxomab

Triomab

EpCAM，CD3

T细胞的招募，Fc介导效应器功能

Neovii

欧盟批准

EpCAM阳性肿瘤恶性腹水

AGOStudyGroup

完成II期，NCT00189345

铂难治性卵巢上皮癌

AIO-Studien-gGmbH

II期，NCT01504256

胃腺癌

GrupoEspañoldeInvestigaciónenCáncerdeOvario

II期，NCT01246440

卵巢癌

GustaveRoussy

II期，NCT01784900

胃腹膜癌扩散

Ertumaxomab

Triomab

HER2，CD3

T细胞的招募，Fc介导效应器功能

KrankenhausNordwest

I/II期，NCT01569412

Her2/Neu阳性晚期实体瘤

FBTA05

TrioMab

CD20，CD3

T细胞招募

慕尼黑技术大学

I/II期，NCT01138579

白血病

Blinatumomab

BiTE

CD3，CD19

T细胞招募

安进（慕尼黑）

美国批准

淋巴细胞白血病

I期，NCT00274742

复发非霍奇金淋巴瘤

II期，NCT01207388

B细胞淋巴细胞白血病

II期，NCT01209286

复发/难治性淋巴细胞白血病

NationalCancerInstitute

II期，NCT02568553

非霍奇金淋巴瘤

II期，NCT02143414

成人b淋巴细胞白血病t（9;22）（q34;q11.2）;BCR-ABL1;未经治疗的成人淋巴细胞白血病

III期，NCT02003222

BCR-ABL阴性B淋巴细胞白血病

Solitomab（MT110，AMG110）

BiTE

CD3，EpCAM

T细胞招募

安进（慕尼黑）

I期完成，NCT00635596

实体肿瘤

AMG330

BiTE

CD33，CD3

T细胞招聘

安进

I期，NCT02520427

复发/难治性非霍奇金淋巴瘤

MT112（BAY2010112）

BiTE

PSMA，CD3

T细胞招聘

拜耳

I期，NCT01723475

前列腺肿瘤

MT111（MEDI-565）

BiTE

CEA，CD3

T细胞招聘

MedImmuneLLC

I期完成，NCT01284231

胃肠道腺癌

BAY2010112

BiTE

CD3，PSMA

T细胞招聘

拜耳

I期，NCT01723475

前列腺肿瘤

MDX447

2（Fab’）交联

CD64,EGFR

激活单核细胞杀死肿瘤

Dartmouth-Hitchcock医疗中心

I期完成，NCT00005813

大脑和中枢神经系统肿瘤

TF2

Dockandlock

CEA,HSG

酶联免疫吸附检测

新泽西州癌症中心分子医学和免疫中心

I期，NCT00895323

结肠直肠癌

放射免疫疗法

CentreRenéGauducheau

I/II期，NCT01221675

小细胞肺癌

Immuno-PET

南特大学医院

I/II期，NCT01730638

复发甲状腺髓样癌

Immuno-PET

南特大学医院

I/II期，NCT01730612

HER2阴性乳腺癌表达CEA

放射免疫疗法

内梅亨大学

I期完成，NCT00860860

结直肠肿瘤

rM28

串联scFv

CD28，HMV-MAA

自体淋巴细胞重靶向肿瘤

图宾根大学医院

I/II期，NCT00204594

恶性黑色素瘤

HER2Bi-aATC

T细胞预装bsAbs

CD3，HER2

激活T细胞

BarbaraAnnKarmanosCancer

Institute

I期，NCT02470559

卵巢、输卵管或原发性腹膜癌

GD2Bi-aATC1877509

T细胞预装bsAbs

CD3，GD2

激活T细胞

BarbaraAnnKarmanosCancer

Institute

I/II期，NCT02173093

儿童和年轻人神经母细胞瘤和骨肉瘤

I期完成，NCT00938626

多发性骨髓瘤和浆细胞肿瘤

I期完成，NCT00244946

非霍奇金淋巴瘤

EGFRBi-aATC

T细胞预装bsAbs

CD3，EGFR

自体激活T细胞EGFR阳性肿瘤

BarbaraAnnKarmanosCancer

Institute

I/II期，NCT02521090

成年人大脑胶质母细胞瘤;复发成人脑神经胶质瘤

MGD006

DART

CD123，CD3

T细胞重靶向肿瘤

MacroGenics

I期，NCT02152956

复发/难治性急性髓细胞白血病（AML）

MGD007

DART

gpA33，CD3

T细胞重靶向肿瘤

MacroGenics

I期，NCT02248805

结直肠癌

MGD010

DART

CD32B，CD79B

MacroGenics

I期，NCT02376036

健康受试者

Anti-CEA×anti-DTPA

scFv-IgG

CEA，di-DTPA-131I

放射免疫疗法

南特大学医院

II期完成，NCT00467506

甲状腺髓样癌

DT2219ARL

2scFv偶联白喉毒素

CD19，CD22

蛋白毒素靶向肿瘤

共济会癌症中心

I期，NCT00889408

白血病，淋巴瘤

I/II期，NCT02370160

复发或难治性B系白血病或淋巴瘤

IMCgp100

ImmTAC

CD3，gp100

T细胞招募

Immunocore

I期，NCT01211262

恶性黑色素瘤

I期，NCT02570308

葡萄膜黑色素瘤

Indium-labeledIMP-205xm734

不清楚

CEA，内标记肽

核成像

内梅亨大学

I期，NCT0018508

结肠直肠癌

LY3164530

OrthoFab-IgG

MET，EGFR

阻断2个受体

礼来

I期，NCT02221882

肿瘤;肿瘤转移

OMP-305883

DVD-Ig

DLL4，VEGF

2配体失活

OncoMed

I期，NCT02298387

晚期固体恶性肿瘤

REGN1979

不清楚

CD20，CD3

T细胞招募

Regeneron制药

I期，NCT02290951

CD20阳性B细胞恶性肿瘤

COVA322

IgG-fynomer

TNF-α，IL17A

两种炎症因子阻断

Covagen

I/II期，NCT02243787

斑块性银屑病

RG7802

CrossMab

CEA，CD3

T细胞招聘

罗氏公司

I期，NCT02324257

固体肿瘤

RG7813（RO6895882）

ScFv-IgG

CEA，IL2

的细胞因子

罗氏公司

I期，NCT02004106

晚期和/或转移性固体CEA阳性肿瘤

RG7221（RO5520985）

CrossMAb

Ang-2，VEGF

2配体失活

罗氏公司

II期，NCT01688206

肿瘤

RG7716

CrossMAb

VEGF，Ang-2

2配体失活

罗氏公司

II期，NCT02484690

湿性AMD

MM-111

HASbody

HER2，HER3

阻断两个受体

梅里马克制药

I期完成，NCT01097460

乳腺肿瘤

I期完成，NCT00911898

her2扩增实体肿瘤

MM-141

scFv-IgG

IGF-IR，HER3

阻断两个受体

梅里马克制药

I期，NCT01733004

肝细胞癌

II期，NCT02399137

胰腺癌

MOR209/ES414

scFv-IgG

PSMA，CD3

T细胞招募

紧急产品开发西雅图LLC

I期，NCT02262910

前列腺癌

TargomiRs

不清楚

EGFR，EDV

传递纳米粒子

悉尼大学

I期，NCT02369198

反复恶性胸膜间皮瘤（MPM）和非小细胞肺癌

MSB0010841

Nanobody

IL-17A/F

阻断2炎症因子

德国默克制药公司

I期，NCT02156466

牛皮癣

alx-0061

Nanobody

IL-6R，HSA

阻断炎症因子，结合HSA增加半衰期

Ablynx

I/II期完成，NCT01284569

类风湿性关节炎

Ozoralizumab（atn-103）

Nanobody

TNF，HSA

阻断炎症因子，结合HSA增加半衰期

Ablynx

II期完成，NCT01063803

类风湿性关节炎

AFM13

TandAb

CD30，CD16A

激活NK细胞

科隆大学

II期，NCT02321592

复发或难治性霍奇金淋巴瘤

AFM11

TandAb

CD30，CD19

重定向的T细胞

AffimedGmbH

I期，NCT02106091

复发和/或耐火CD19阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤

SAR156597

scFv-IgG

IL4，IL13

阻断炎症因子

赛诺菲安万特

I/II期完成，NCT01529853

突发性肺纤维化

II期，NCT02345070

突发性肺纤维化

BsAbs主要是由三种方法制成[7]：

（1）细胞杂交瘤技术是基于两种不同的杂交瘤细胞系的细胞融合，

（2）化学结合，包括化学交联，（3）利用DNA重组技术的遗传学方法。

这些技术革新了bsAbs的开发，满足特定应用的各种类型BsAbs被开发出来，其中部分在本文中进行了讨论。

2BsAb类型

BsAbs大致可以分为两类：

免疫球蛋白G（IgG）样分子和非IgG样分子（图1）。

IgG样BsAbs保留F介导效应功能，如抗体依赖细胞介导细胞毒性（ADCC）、补体依赖细胞毒性（CDC）和抗体依赖细胞吞噬作用（ADCP）[6]。

BsAbs的Fc区域使纯化变得容易，同时提高了抗体的溶解性和稳定性。

IgG样类型的BsAbs由于他们分子结构较大以及FcRn介导的回收作用，因而具有更长的半衰期[8]。

非IgG样BsAbs由于分子结构较小，使其获得了更强的组织渗透力[8]。

图1双特异性抗体分子类型

2.1IgG样类型

2.1.1杂交瘤细胞

杂交瘤细胞技术依赖于融合两个截然不同的杂交瘤细胞。

Ig的重链和轻链随机配对就产生了bsAbs[9]。

在这个过程中，同时也生成了非功能性抗体。

采用杂交瘤细胞技术生产的BsAbs与传统的抗体相似。

Catumaxomab，第一个获批的bsAb，就是由老鼠/小鼠杂交瘤细胞系生产的。

2.1.2Knobs-into-holes

生产带Fc片段的bsAbs会带来一些挑战，如生成不希望出现的同型二聚体或其他一些错配的杂质分子。

“knobs-into-holes”方法通过在一个抗体的CH3区域用大分子氨基酸替换掉小分子氨基酸形成“knob”，同时在另一个抗体中采用相反的方式处理形成“hole”，二者结合后形成杂合抗体，采用此方法就可以解决Fc部分错配问题[10]。

从理论上讲，任何两个不同的抗体都可以采用“knobs-into-holes”方法形成异型二聚体。

然而，“轻链错配”又带来了另一个挑战。

为了避免这个问题，人们又提出了几种解决方法：

A）采用共有轻链生成bsAbs[11]。

然而，在这个策略中，结合特异性受限制且不是对所有bsAbs都适用。

B）在不同的菌体中分别表达一半的“knob”和“hole”。

这种方法可以避免轻链错配。

然而，在细菌细胞中表达会导致失去关键的糖基化修饰，这可能影响抗体效应器功能（如抗体依赖细胞毒性由糖基与Fcγ受体结合后诱导产生）[12]。

C）结合CrossMab和knobs-into-holes策略来将错配减到最低程度。

在CrossMab抗体中，将重链的CH1结构域与轻链相应的CL结构域进行交换，以促使轻链正确配对[13]。

采用knobs-into-holes和CrossMab策略，罗氏制成了针对Ang-2和VEGFA的双特异抗体A2VCrossMab[14]。

D）在VH-VL和CH1-CL之间引入额外的突变。

这些突变促使重链优先与轻链结合[15]。

该方法的一个缺点是，它需要在抗体保守区进行大范围的突变。

2.1.3双可变结构域Ig（Dual-variabledomainsIg,DVD-Ig）

两个单克隆抗体的可变区采用串联的方式融合在一起形成一个双特异性IgG样分子[16]。

DVD-Ig的每个Fab都能与两个靶点结合。

从理论上讲，任何一对单克隆抗体都可以用于制成一个DVD-Ig分子。

由此产生的特定抗体可以进一步修饰以改变其结合价和特异性。

该技术避免了不同重链和轻链间的错配，同时也能提高产品的产量、均一性和稳定性。

此外，Fc区还有利于纯化。

然而，有一个潜在的风险，靠里面的可变区亲和力可能会变弱[17]。

2.1.4IgG-单链抗体（IgG-scFv）

将一个单链抗体或单独一个可变区结构融合到轻链或重链的末端形成IgG-scFv。

这种类型的抗体也包含在DVD-Igs内。

2.1.5二合一（two-in-one）或双功能Fab（DAF）抗体

DAF抗体的抗原结合位点能够识别双抗原[18]。

为了达到这个目标，首先需要确定一个能结合目标抗原的模板抗体。

然后通过对抗原结合位点进行突变以识别第二抗原。

接下来的工作是进一步抗原结合位点的双亲和力。

然而，二合一抗体也不能同时结合两种不同的抗原（抗原表位）。

2.1.6半分子交换（Half-moleculeexchange）

人类血清中，IgG4可以进行半分子交换，这促使了可称为“半分子交换”的IgG4bsAbs构建策略的诞生。

在IgG1CH3部位引入点突变后，IgG1抗体可以在可控的条件下进行半分子交换而形成bsAbs[19]。

这种策略也适用于人类的IgG2和IgG3。

这种方法的最重要的优点是可以先分别表达亲代IgGs，然后通过调控形成不同的子代bsAbs。

因此，该方法可以简便的在短期内制备大量bsAbs。

此外，采用半分子交换形成的bsAbs保持了抗体的天然结构，免疫原性低。

2.1.7κλ-抗体

一条重链和两条具有不同结合特异性的轻链（κ和λ）可以在一个细胞中进行共表达。

这样，可以在同一个重链上结合κ和λ轻链，从而制成bsAbs[20]，然后由高度选择性亲和树脂纯化。

κλ-抗体的优点是显而易见的：

首先，bsAbs未经修饰，保留完整的人IgG型式；其次，bsAbs可以很容易的从抗体混合物中纯化出来；第三，bsAbs可以以工业规模生产；最后，纯化平台可以应用于所有κλ-body，从而可以并行开发不同的bsAbs[20]。

2.2非IgG样类型

2.2.1基于单链抗体的bsAbs（scFv-basedbsAbs）

单链抗体仅由用于结合抗原的VL和VH两部分组成。

通过修改链接区长度、抗体序列和外部因素，ScFvs可被制成二聚体、三或四聚体[21]。

与正常IgG分子相比，scFvs具有更高的肿瘤特异性和组织渗透力；因此，基于单链抗体的bsAbs备受青睐，并有几个可能应用于临床。

2.2.1.1串联单链抗体

两个单链抗体通过一个灵活的连接肽如甘氨酸-丝氨酸重复基序连接起来形成串联结构[7]。

采用短连接肽可防止VH和VL结构域中出现链见配对。

采用长连接肽则可使抗原结合位点能够自由旋转。

著名的双特异性T细胞连接器（BiTE）技术就是基于这种格式的。

2.2.1.2双价抗体型式（Diabody）

在双价抗体结构中，两个不同抗体的可变区分别由两个连接肽连接起来。

第一个抗体的VH与第二个抗体的VL相连，同时第一个抗体的VL和第二个抗体的VH相连。

两个连接肽增加了抗体的稳定性。

然而，这两个连接肽也限制了抗原结合位点的移动性，从而限制了抗原的识别。

2.2.1.3单链双价抗体

双价抗体型式可以通过链间增加一段连接肽制成单链双价抗体。

2.2.1.4串联双价抗体（TandAbs）

当两对VL和VH通过一个单链连接起来后，制成一个四价TendAb。

2.2.1.5双亲和重靶向分子（DARTs）

DARTs是将第一个可变区的VH与第二条链的VL连接，同时将第二可变区的VH与第一条链的VL连接形成一个VLA-VHB+VLB-VHA型式的复合物[22]。

链间引入二硫键来增加抗体的稳定性[22]。

DARTs由于尺寸较小导致其容易被机体清除。

为了避免这种情况，MacroGenics在DARTs上融合了一个Fc片段以延长其血清保留时间[23]。

2.2.2纳米抗体（Nanobodies）

纳米抗体是天然形成的最小的抗体，它只有重链部分（15kDa）[24]。

纳米抗体可以在缺少轻链的情况下与相应的抗原结合。

来自美洲驼和骆驼的具有不同结合特异性的纳米抗体已经被短链连接起来形成bsAbs[25]。

2.2.3Dock-and-lock（DNL）方法

将抗体片段与异型二聚化蛋白（如cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）和A激酶结合蛋白（AKAP））进行融合。

当蛋白质形成异型二聚体后，就行成了双特异性抗体[26]。

2.2.4其它双特异性或多特异性分子

ScFvs还可以连接到其他分子如细胞因子TNF-α（天然的TNF-α以三聚物的形式存在）、胶原蛋白XV或XVIII的三聚结构、拉链二聚作用域（Fos或Jun）来生成多价分子[6]。

2.3延长半衰期策略

基于单链抗体的bsAbs有很多优势，比如易于制造，组织渗透力强，此外，他们还可以与完整抗体因空间位阻不能结合的抗原表位进行结合。

进一步说，他们因缺少Fc区域而具有更低的免疫原性，从而避免被FcR所吸收。

但是，基于单链抗体的bsAbs由于其半衰期短也导致了几个缺点，如血液清除快、fastoffrates和针对靶点（如肿瘤）保留时间短。

在临床应用中，血清半衰期短的药物需增加给药频率和量[27]。

因此，延长血清半衰期在经济和治疗两方面都有益。

有几种策略可以延长bsAbs的血清半衰期，如:

2.3.1聚乙二醇化

附加高度灵活、亲水的分子如PEG可以增加bsAbs的体积，从而提高他们的血清半衰期。

然而，附加PEG的数量和尺寸链会导致抗体部分失活或亲和力降低[28]。

定点结合一个单链PEG链的方式似乎是一个理想的策略[27]。

2.3.2与人血清白蛋白或半结合清蛋白融合

将scFvs与HSA或半结合清蛋白融合可以延长其的血清半衰期。

此外，HSA与FcRn相互作用不会改变抗原结合的亲和力。

这种策略被抗体工程师广泛采用。

抗体与白蛋白融合/结合后不仅增加了其分子的大小，还能促进bsAbs再利用，延长半衰期。

白蛋白被细胞吸收后，会首先与早期内涵体上的FcRn结合，从而避免被破坏。

然后，白蛋白被重新运送到细胞质膜并释放到血浆[27]。

梅里马克公司（Merrimack）采用这个方法成功开发出MM-111。

Ozoralizumab（ATN-103，Ablynx）是一种来自于骆驼的重链制成的分子量为38kDa的三价双特异性纳米抗体。

理论上，这样的小分子药物容易被肾脏清除。

为了解决这个问题，ozoralizumab被设计成与HAS结合，保留了其结合TNF-α[29]的特异性。

2.3.3与Fc片段融合

一些抗体工程师将Fc片段与基于单链抗体的bsAbs融合。

Fc的片段不仅提高了分子的大小，还能通过FcRn促进再利用。

MacroGenics开发出Fc-bearingDARTMGD007用于治疗结肠癌患者。

2.3.4多聚化

多聚化是另一个通过调整大小和结合力来优化bsAb半衰期的策略。

3BsAbs的临床应用

3.1BsAbs重定向免疫效应细胞以缩短其与肿瘤细胞的距离

细胞毒性T淋巴细胞在对抗癌症细胞的免疫反应中发挥着重要作用[30]。

然而，在免疫反应过程中，肿瘤特异性T细胞反应往往受限于被肿瘤细胞利用的免疫逃逸机制。

免疫疗法在过去几年中的进展已经可以克服这一挑战。

一个利用免疫细胞的策略是利用bsAbs来杀死肿瘤细胞。

几个正在进行临床实验的bsAbs被设计成将T细胞重定向至肿瘤细胞[31]。

这个过程伴随着在T细胞和肿瘤细胞间形成临时的溶细胞突触。

随后T细胞的激活和增殖导致肿瘤细胞被裂解[32]。

除了T细胞，其他免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞