SDSPAGE操作方法要点Word文件下载.docx

1、【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。1 M Tris-HCl（pH6.8）（浓缩胶buffer）【组分浓度】1 M Tris-HCl名称用量Tris12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml（36%的浓盐酸）预实验已确定加入去离子水定容至100ml后，室温保存称量12.1 g Tris碱溶于80 mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9 mL的浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后

2、再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1，溶液的pH值大约降低0.03个单位。室温保存。对人体有刺激性，请注意适当防护。1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）（分离胶buffer）【组分浓度】1.5 M Tris-HCl18.17 g80 mL3 mL加入去离子水定容至100 mL后，室温保存【配制方法】100 mL称量18.17 g Tris碱溶于80 mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约3 mL浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。室温保存10% 十二烷基硫酸钠SDS溶液-10%（w/v）SDS 【组分浓度】

3、10% （w/v） SDSSDS8 mL加入去离子水定容至10 ml后，室温保存称取2 g高纯度的SDS置于100200 mL烧杯中，加入约16 mL的去离子水，于68 加热溶解，滴加浓盐酸调节pH至7.2，定容至20mL后，室温保存。保存条件：4保存。注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护。易挥发，使用后请盖紧瓶盖。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套对人体有害，请注意防护。10% 过硫酸铵溶液-10% （w/v） APS【组分浓度】10% （w/v） 过硫酸铵（APS）过硫酸铵0.1 g1 mL现配现用称取0.1 g过硫酸铵置于1.5

4、 mL离心管，加1 mL去离子水吹打溶解，亦可以加倍，即称取1 g过硫酸铵，加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。4 保存。4保存10%过硫酸铵溶液在4保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。5Tris-甘氨酸电泳缓冲液-Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）配制不同体积所需各成分的体积（mL）或质量（g）1000ml500ml0.125M Tris15.1g1.25M glycine（甘氨酸）94.0g0.5%（W/V）SDS5.0g称取15.1 g Tris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌

5、溶解，定容至1000 mL，室温保存。得0.125 mol/L Tris-1.25 mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。室温保存，两年有效。配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。 SDS-PAGE加样缓冲液-SDS-PAGE Loading Buffer 【组分浓度】0.25 M Tris-HCl （pH 6.8）；10% （W/V）SDS；0.5% （W/V） BPB（溴酚蓝）；50% （V/V） 甘油；5% （W/V） -巯基乙醇（2-ME）或0.5 M DTT（二硫糖醇）配制用量总体积10 mL1

6、 M Tris-HCl （pH 6.8）2.5 mLBPB（溴酚蓝）50 mg甘油5 mL（0.5 mL/份）分装，室温保存，使用前加25 L 2-ME/小份，保存一个月左右。-巯基乙醇（2-ME） 0.5 mL量取1.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8），0.5 g SDS，25 mg BPB，2.5 mL甘油，置于10 mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5 mL，小份（0.5 mL/份）分装，于室温保存。使用前将25 L的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。-20保存，至少一年有效。SDS-PAGE蛋白上样缓冲

7、液（5X）中含少量DTT或-巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。二者作用相似，但DTT 的刺激性和毒性都低于-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于-巯基乙醇。DTT的最佳工作pH围为7.1-8.0，但DTT价格略高一些。蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是1-10 mM。摘自Takara 商品目录-实验室常规试剂配制方法 TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R-250染色液 【组分浓度】0.1%（w/v）考马斯亮蓝R-250，25%（v/v）异丙醇，10%（v/v）冰醋酸1000 ml考马斯亮蓝R-2501.0 g可以多加点，最好在摇床上摇摇，多溶解些。异丙醇250 mL搅拌溶解，可用甲

8、醇或乙醇替代。甲醇固定效果好，但甲醇难闻且对身体有害。乙醇浓度太大会使胶皱缩。冰醋酸搅拌均匀650 mL搅拌均匀，滤纸快速过滤除去颗粒物，室温保存考马斯亮蓝R250染色，染色时间控制在0.5-1h。（注意：（1）保存考马斯亮蓝R250可回收使用，可保存很长时间，但一般不超过6个月；（2）染色时间过长难以脱色，过短染色效果不佳；）考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%（v/v）醋酸，5%（v/v）乙醇乙醇一般加的量与染色液相同，只是不加R-250充分混匀后使用脱色（三个小时后应换次脱色液，再重新加入脱色液且约需脱色24小时，直到背景清晰为止）（1）蒸馏水中冲洗2-3次（2）7冰乙酸固定（3）7冰

9、乙酸 10乙醇83ml蒸馏水脱色（4）7冰乙酸保存（要检测脱色后的胶，则需保存于7冰乙酸中）蒸馏水冲洗7冰乙酸（关键步骤），10乙醇脱色脱色液：7冰乙酸 ，10乙醇，83ml蒸馏水7冰乙酸保存（蒸馏水冲洗后用7冰乙酸保存且约二四天后再照胶，条带更为清晰）。银氨染色用凝胶固定液（质谱用）【组分浓度】 50% （V/V） 甲醇，10% （V/V） 醋酸甲醇500 mL醋酸400 mL充分混匀后室温保存银氨染色用凝胶处理液【组分浓度】50% （v/v） 甲醇，10% （v/v） 戊二醛50 mL戊二醛40 mL银氨染色用凝胶染色液【组分浓度】0.4% （w/v） AgNO3，1% （v/v） 浓NH

10、3H2O，0.04% （w/v） NaOH20% AgNO32 mL浓NH3H2O4% NaOH96 mL取上述试剂加入100 200 mL的试剂瓶中，均匀混合。该溶液应为无色透明状。如果氨水浓度过低时溶液会呈混浊状，此时应补加浓氨水直至透明。本染色液应现用现配，不宜保存。银氨染色用显影液【组分浓度】0.005% （w/v） 柠檬酸，0.02% （v/v） 甲醛柠檬酸甲醛0.2 mL定容至1 L后充分混匀，室温保存SDS-PAGE凝胶配方1） 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶（即下层胶）：丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶最佳分离围5%60-

11、212 kDa7.5%30-120 kDa10%18-75 kDa12%12-60 kDa15%15-45 kDa来源于蛋白质技术手册汪家政每种浓度的变性胶的分离围不是指能跑出哪个围分子量的蛋白质，而是指在这个区间，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶510152025304050蒸馏水2.65.37.910.613.215.921.226.51.02.03.04.05.06.08.010.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.86.37.512.

12、510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%胶2.34.66.99.311.513.916.523.22.76.710.713.30.0030.0060.0090.0150.0180.0310%胶1.95.99.911.919.81.73.38.316.70.0020.0112%胶1.64.96.68.212.016.020.015%胶1.13.45.79.215.025.0注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。1） 按照如下

13、表格配制SDS-PAGE的浓缩胶（也称堆积胶、积层胶或上层胶）：配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%浓缩胶1234680.681.42.14.15.56.80.170.330.670.831 M Tris,pH8.80.130.380.630.751.250.060.080.0010.005TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL（pH7.5）100mLNacl16gKCL0.4g吐温1mlWestern blot用的缓冲溶液。1） 抗体去除液每50mL抗体去除液中含：0.5M TrisHCL（pH6.8）6.25mL10mLBeta-ME0.175mL水

14、33.75mLSDS-PAGE操作方法1、20uL 收集液，加入 5样品缓冲液 5ul，在 80水浴锅中煮 5min。按照上面配方制 SDS-PAGE 凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。3、按一定顺序在加样孔中加入样品，根据 SDS-PAGE 电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般 0.75mm 间隙 15 孔的上样量10uL/孔,1mm 间隙 10 孔的上样量20ul/孔。上样量根据实际经验自己掌握。4、打开电源将电压调到 80v（一般 15min 左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到 120v 至样品电泳到胶底部为止。5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇 23h

15、6、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜7、将脱色液倒掉，可以用 Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天胶的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。借鉴Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的SDS-PAGE中加入约13%的甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。只要把原来配方

16、中的水换成60%的甘油，就可以了。在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！特别是对分离糖蛋白的时候很有用处！一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生,另一方面对分离小分子量的蛋白有好处!一般加的量在0.53g尿素/12ml分离胶！自己可以跑来实验一下你跑9KD分子量的蛋白，建议用tricine-sds-page电泳来跑！也可以在分离胶中加尿素！以我经验来看，加尿素会好于甘油！电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。待染料前沿移动至管底近处，停止

17、电流。电泳时间为1-2小时。加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。拍胶时的“黑十字”聚焦法！很多人用相机的微距聚焦都无法使识别框变绿，其实你只需要在胶所在的平面划一个黑十字就可以

18、很好的聚焦，尤其是western blot的图，直接在膜的边上划就可以聚焦SDSPAGE的话可以找个颜色深东西放在胶的边上就可以了，把镜头对准它。SDS-PAGE注意事项1、胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量。2、下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用。至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一