SDSPAGE操作方法要点Word文件下载.docx
《SDSPAGE操作方法要点Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SDSPAGE操作方法要点Word文件下载.docx（22页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
【注意事项】
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
1MTris-HCl（pH6.8）（浓缩胶buffer）
【组分浓度】1MTris-HCl
名称
用量
Tris
12.1g
去离子水
80ml
浓盐酸
9ml
（36%的浓盐酸）预实验已确定
加入去离子水定容至100ml后，室温保存
称量12.1gTris碱溶于80mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9mL的浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100mL，高温高压灭菌后，室温保存。
应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
室温保存。
对人体有刺激性，请注意适当防护。
1.5MTris-HCl（pH8.8）（分离胶buffer）
【组分浓度】1.5MTris-HCl
18.17g
80mL
3mL
加入去离子水定容至100mL后，室温保存
【配制方法】100mL
称量18.17gTris碱溶于80mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约3mL浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100mL，高温高压灭菌后，室温保存。
室温保存
10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%（w/v）SDS
【组分浓度】10%（w/v）SDS
SDS
8mL
加入去离子水定容至10ml后，室温保存
称取2g高纯度的SDS置于100~200mL烧杯中，加入约16mL的去离子水，于68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节pH至7.2，定容至20mL后，室温保存。
保存条件：
4℃保存。
注意事项：
易燃，有腐蚀性，请注意防护。
易挥发，使用后请盖紧瓶盖。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套对人体有害，请注意防护。
10%过硫酸铵溶液-----10%（w/v）APS
【组分浓度】10%（w/v）过硫酸铵（APS）
过硫酸铵
0.1g
1mL
现配现用
称取0.1g过硫酸铵置于1.5mL离心管，加1mL去离子水吹打溶解，亦可以加倍，即称取1g过硫酸铵，加入10mL的去离子水后搅拌溶解。
4℃保存。
4℃保存
10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。
5×
Tris-甘氨酸电泳缓冲液-----
Tris-Glycinebuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）
配制不同体积所需各成分的体积（mL）或质量（g）
1000ml
500ml
0.125MTris
15.1g
1.25Mglycine（甘氨酸）
94.0g
0.5%（W/V）SDS
5.0g
称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000mL，室温保存。
得0.125mol/LTris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。
临用前稀释5倍。
室温保存，两年有效。
配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。
电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。
SDS-PAGE加样缓冲液-----
SDS-PAGELoadingBuffer
【组分浓度】0.25MTris-HCl（pH6.8）；
10%（W/V）SDS；
0.5%（W/V）BPB（溴酚蓝）；
50%（V/V）甘油；
5%（W/V）β-巯基乙醇（2-ME）或0.5MDTT（二硫糖醇）
配制用量
总体积
10mL
1MTris-HCl（pH6.8）
2.5mL
BPB（溴酚蓝）
50mg
甘油
5mL
（0.5mL/份）分装，室温保存，使用前加25μL2-ME/小份，保存一个月左右。
β-巯基乙醇（2-ME）
0.5mL
量取1.25mL1MTris-HCl（pH6.8），0.5gSDS，25mgBPB，2.5mL甘油，置于10mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5mL，小份（0.5mL/份）分装，于室温保存。
使用前将25μL的2-ME加入到每小份中。
加入2-ME的LoadingBuffer可在室温下保存一个月左右。
-20℃保存，至少一年有效。
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）中含少量DTT或β-巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。
二者作用相似，但DTT的刺激性和毒性都低于β-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于β-巯基乙醇。
DTT的最佳工作pH围为7.1-8.0，但DTT价格略高一些。
蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是1-10mM。
摘自Takara商品目录--实验室常规试剂配制方法
TEMED原液直接使用
考马斯亮蓝R-250染色液【组分浓度】0.1%（w/v）考马斯亮蓝R-250，25%（v/v）异丙醇，10%（v/v）冰醋酸
1000ml
考马斯亮蓝R-250
1.0g
可以多加点，最好在摇床上摇摇，多溶解些。
异丙醇
250mL
搅拌溶解，可用甲醇或乙醇替代。
甲醇固定效果好，但甲醇难闻且对身体有害。
乙醇浓度太大会使胶皱缩。
冰醋酸
搅拌均匀
650mL
搅拌均匀，滤纸快速过滤除去颗粒物，室温保存
考马斯亮蓝R250染色，染色时间控制在0.5-1h。
（注意：
（1）保存考马斯亮蓝R250可回收使用，可保存很长时间，但一般不超过6个月；
（2）染色时间过长难以脱色，过短染色效果不佳；
）考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%（v/v）醋酸，5%（v/v）乙醇
乙醇
一般加的量与染色液相同，只是不加R-250
充分混匀后使用
脱色（三个小时后应换次脱色液，再重新加入脱色液且约需脱色24小时，直到背景清晰为止）
（1）蒸馏水中冲洗2-3次
（2）7％冰乙酸固定
（3）7％冰乙酸10％乙醇83ml蒸馏水脱色
（4）7％冰乙酸保存（要检测脱色后的胶，则需保存于7％冰乙酸中）
蒸馏水冲洗→7％冰乙酸（关键步骤），10％乙醇脱色
脱色液：
7％冰乙酸，10％乙醇，83ml蒸馏水
7％冰乙酸保存（蒸馏水冲洗后用7％冰乙酸保存且约二～四天后再照胶，条带更为清晰）。
银氨染色用凝胶固定液（质谱用）
【组分浓度】50%（V/V）甲醇，10%（V/V）醋酸
甲醇
500mL
醋酸
400mL
充分混匀后室温保存
银氨染色用凝胶处理液【组分浓度】50%（v/v）甲醇，10%（v/v）戊二醛
50mL
戊二醛
40mL
银氨染色用凝胶染色液【组分浓度】0.4%（w/v）AgNO3，1%（v/v）浓NH3·
H2O，0.04%（w/v）NaOH
20%AgNO3
2mL
浓NH3·
H2O
4%NaOH
96mL
取上述试剂加入100~200mL的试剂瓶中，均匀混合。
该溶液应为无色透明状。
如果氨水浓度过低时溶液会呈混浊状，此时应补加浓氨水直至透明。
本染色液应现用现配，不宜保存。
银氨染色用显影液【组分浓度】0.005%（w/v）柠檬酸，0.02%（v/v）甲醛
柠檬酸
甲醛
0.2mL
定容至1L后充分混匀，室温保存
SDS-PAGE凝胶配方
1）根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶（即下层胶）：
丙烯酰胺在凝胶中的百分比
分离胶最佳分离围
5%
60-212kDa
7.5%
30-120kDa
10%
18-75kDa
12%
12-60kDa
15%
15-45kDa
来源于《蛋白质技术手册》汪家政
每种浓度的变性胶的分离围不是指能跑出哪个围分子量的蛋白质，而是指在这个区间，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。
成分
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
6%胶
5
10
15
20
25
30
40
50
蒸馏水
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
21.2
26.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
8.0
10.0
1.5MTris,pH8.8
1.3
2.5
3.8
6.3
7.5
12.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.4
0.5
10%过硫酸铵
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
0.032
0.04
8%胶
2.3
4.6
6.9
9.3
11.5
13.9
16.5
23.2
2.7
6.7
10.7
13.3
0.003
0.006
0.009
0.015
0.018
0.03
10%胶
1.9
5.9
9.9
11.9
19.8
1.7
3.3
8.3
16.7
0.002
0.01
12%胶
1.6
4.9
6.6
8.2
12.0
16.0
20.0
15%胶
1.1
3.4
5.7
9.2
15.0
25.0
注：
如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。
1）按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶（也称堆积胶、积层胶或上层胶）：
配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）
5%浓缩胶
1
2
3
4
6
8
0.68
1.4
2.1
4.1
5.5
6.8
0.17
0.33
0.67
0.83
1MTris,pH8.8
0.13
0.38
0.63
0.75
1.25
0.06
0.08
0.001
0.005
TBST缓冲液
每2L体积中含：
1MTrisHCL（pH7.5）
100mL
Nacl
16g
KCL
0.4g
吐温
1ml
Westernblot用的缓冲溶液。
1）抗体去除液
每50mL抗体去除液中含：
0.5MTrisHCL（pH6.8）
6.25mL
10mL
Beta-ME
0.175mL
水
33.75mL
SDS-PAGE操作方法
1、20uL收集液，加入5×
样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。
按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。
3、按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般0.75mm间隙15孔的上样量<
10uL/孔,1mm间隙10孔的上样量<
20ul/孔。
上样量根据实际经验自己掌握。
4、打开电源将电压调到80v（一般15min左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。
5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇2－3h
6、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜
7、将脱色液倒掉，可以用QualityOne，或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。
SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。
所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天胶的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：
冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。
借鉴Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的SDS-PAGE中加入约13%的甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。
只要把原来配方中的水换成60%的甘油，就可以了。
在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！
特别是对分离糖蛋白的时候很有用处！
一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生,另一方面对分离小分子量的蛋白有好处!
一般加的量在0.5－3g尿素/12ml分离胶！
自己可以跑来实验一下你跑9KD分子量的蛋白，建议用tricine-sds-page电泳来跑！
也可以在分离胶中加尿素！
以我经验来看，加尿素会好于甘油！
电泳在二液槽中安放铂金丝电极；
正极在下，负极在上。
接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。
室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。
蛋白质向正极移动。
待染料前沿移动至管底近处，停止电流。
电泳时间为1-2小时。
加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。
然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。
脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。
效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。
方便快捷！
放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。
拍胶时的“黑十字”聚焦法！
很多人用相机的微距聚焦都无法使识别框变绿，其实你只需要在胶所在的平面划一个黑十字就可以很好的聚焦，尤其是westernblot的图，直接在膜的边上划就可以聚焦SDSPAGE的话可以找个颜色深东西放在胶的边上就可以了，把镜头对准它。
SDS-PAGE注意事项
1、胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量。
2、下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用。
至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一
升级会员 