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1、SN016992出口食物中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式中华人民共和国进出口商品查验行业标准SN 016992出口食物中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式 代替 ZB X09 002一88Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export1主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2设备和材料吸管: 1mL,具刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。水浴箱：0.5。培养箱：361,0.5。冰

2、箱: 05和-15-20。均质器。乳钵和研棒。平皿：直径90mm。天平：感量0.1g。显微镜。 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 玻璃珠：直径约5mm。 菌落计数器。3培育基及试剂月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 EC 肉汤。伊红美蓝琼脂(EMB)。营养琼脂斜面。色氨酸肉汤。 MR-VP培养基。 Korser氏枸椽酸盐肉汤。结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 生理盐水。 革兰氏染色液。 Kovacs氏靛基质试剂。 甲基红指示剂。 Voges-pros kauer(V-P)试剂。4样品

3、制备以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15保留；非冷冻而易腐的食物,应置于4冰箱保留。检验前冷冻样品可于25 18h内解冻,或在45以下15min内解冻。不同食品样品匀液的制备4.2.1液体食物以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。固体和半固体食品以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质12min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法

4、代替)。稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10*-2、10*-3、10*-4。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。5大肠菌群的测定大肠菌群MPN值的测定5.1.1对每一个样品,选择适宜的三个持续稀释度的样品稀释液。每一个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于361培育482h。观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一步作证实试验。大肠菌群的证明实验5.2.1将

5、所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。置BGLB肉汤管于361培育482h。记录所有BGLB肉汤管的产气管数。结果报告：按BGLB肉汤产气管数,查MPN表见附录B (补充件)报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。6粪大肠菌群测定用直径为3mm的接种环将所有482h内产气的LST肉汤管培育物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖0.5水浴箱内,培育242h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5产气阳性的大肠杆菌和44.5不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌

6、群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。结果报告：按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。7大肠杆菌测定将条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,361培育242h。 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,361培育1824h。将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1色氨酸肉汤：在361培育242h后,加Kovacs氏试剂,上层显现红色为靛基质阳性反应

7、。 MR-VP培养基：在361培育482h。以无菌操作移取培育物1 mL至13mm100mm试管中,加5-萘酚乙醇溶液,40氢氧化钾溶液和少量肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于361培育96h记录有无生长。 LST肉汤：于361培育482h,观看试管中是不是产气。革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛 基 质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定(型别) 典型大

8、肠杆菌 非典型大肠杆菌 典型中间型 非典型中间型 典型产气肠杆菌 非典型产气肠杆菌如显现上表之外的生化反映类型,说明培育物可能不纯,应从头划线分离,必要时做重复试验。结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为或,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。8大肠菌群固体培育基测定法样品制备同第4章。计数8.2.1选取适宜的三个持续稀释度的样品液,每一个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。将冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)1015mL倾注于每一个平皿中。小心旋转平皿,

9、将培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后,再加34mL VRBA覆盖平板表层。翻转平板,置于361培育1824h。选用有30150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。证实从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 361培育24h和48h,观看产气情形。将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。结果报告经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠

10、菌群数。例：10*-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：1006/1010*4/g(mL)10*5/g(mL)附录 A培养基和试剂(补充件)A1月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm150mm试管中,每管10mL。121高压灭菌15min。最终。A2煌绿乳糖

11、胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 煌绿水溶液 蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,用蒸馏水稀释到975mL,调。再加入煌绿水溶液,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121高压灭菌15min。最终。A3 EC肉汤胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g氯化钠 5.0

12、g蒸馏水 将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121高压灭菌15min,最终。A4伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g琼脂 15.0g伊红(水溶性) 0.4g或2水溶液20mL美蓝 0.065g或水溶液13mL蒸馏水 在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。最终。使用前将琼脂融化,于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20乳糖水溶液、2mL的2伊红水溶液和的美蓝水溶液,摇匀,冷至4550倾注平皿。

13、A5营养琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g琼脂 15.0g蒸馏水 将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装合适的试管。121高压灭菌15min。最终。灭菌后摆成斜面备用。A色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨 10.0g蒸馏水 加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管5mL。121高压灭菌15min。最终。A7 MR-VP培育基(月示)胨7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g蒸馏水 将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121高压灭菌15min,最终。A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠(NaNH4HPO44H2O) 1.5g磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g硫酸镁(MgS

14、O47H2O) 0.2g枸椽酸钠(含2H2O)3.0g蒸馏水 将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121高压灭菌15min。最终。A9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)蛋白胨 7.0g酵母膏 3.0g乳糖 10.0g氯化钠 5.0g胆盐或3号胆盐 1.5g中性红 0.03g结晶紫 0.002g琼脂 1518g蒸馏水 将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至。煮沸2min,将培养基冷至4550倾注平板。临历时制备,不得超过3h。A10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液贮存液磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g蒸馏水 500mL将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol

15、/L氢氧化钠约175 mL调至。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。稀释液取贮存液, 用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121高压灭菌15min。A11 生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 将氯化钠溶于蒸馏水中,121高压灭菌15min。A12 革兰氏染色液结晶紫染色液：结晶紫 1.0g95乙醇 1草酸铵水溶液 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g蒸馏水 将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液：沙黄 0.25g95乙醇 蒸馏水 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。染色法a. 将

16、涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。b.滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。c. 滴加95乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。d.滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。A13 Kovacs氏靛基质试剂对二甲氨基苯甲醛 5.0g戊醇 盐酸(浓) 将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。A14 甲基红指示剂甲基红 0.1g95乙醇 300mL将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。A15 Voges-Pros kauer(V-P)试剂甲液-萘酚 5.0g无水乙醇 乙液氢氧化钾 4

17、0.0g用蒸馏水加至 附录 B 1g检样中最近似值(MPN)表 (补充件)使用三管法,接种量分别为,和0.001g。阳 性 管 数 阳 性 管 数 MPN MPN 0 0 0 3 2 0 0 0 0 1 3 2 0 1 140 0 2 6 2 0 2 200 0 3 9 2 0 3 260 1 0 3 2 1 0 150 1 1 2 1 1 200 1 2 2 1 2 270 1 3 12 2 1 3 340 2 0 2 2 0 210 2 1 2 2 1 280 2 2 12 2 2 2 350 2 3 16 2 2 3 420 3 0 2 3 0 290 3 1 13 2 3 1 360

18、3 2 16 2 3 2 440 3 3 19 2 3 3 531 0 0 3 0 0 231 0 1 3 0 1 391 0 2 11 3 0 2 641 0 3 15 3 0 3 951 1 0 3 1 0 431 1 1 11 3 1 1 751 1 2 15 3 1 2 1201 1 3 19 3 1 3 1601 2 0 11 3 2 0 931 2 1 15 3 2 1 1501 2 2 20 3 2 2 2101 2 3 24 3 2 3 2901 3 0 16 3 3 0 2401 3 1 20 3 3 1 4601 3 2 24 3 3 2 11001 3 3 29 3 3

19、31100注: 本表采纳3个稀释度 0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL),每一个稀释度接种3管。 表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,那么表内数字应相应增加10倍,其余类推。附加说明：本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。中华人民共和国国家进出口商品查验局1992-12-28批准 1993-05-01实施