SN016992出口食物中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式.docx

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SN016992出口食物中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式

中华人民共和国进出口商品查验行业标准

SN0169—92出口食物中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式

代替ZBX09002一88

Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport

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1　主题内容与适用范围

　　本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。

　　本标准适用于出口食品的检验。

2　设备和材料

　吸管:

1mL,具刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。

　水浴箱：

±0.5℃。

　培养箱：

36±1℃,±0.5℃。

　冰箱:

0～5℃和-15～-20℃。

　均质器。

　乳钵和研棒。

　平皿：

直径90mm。

　天平：

感量0.1g。

　显微镜。

稀释瓶：

100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。

玻璃珠：

直径约5mm。

菌落计数器。

3　培育基及试剂

　月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤。

　煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。

EC肉汤。

　伊红美蓝琼脂（EMB）。

　营养琼脂斜面。

　色氨酸肉汤。

MR-VP培养基。

Korser氏枸椽酸盐肉汤。

　结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。

　Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。

生理盐水。

革兰氏染色液。

Kovacs氏靛基质试剂。

甲基红指示剂。

Voges-proskauer（V-P）试剂。

4　样品制备

　以无菌操作取有代表性的样品。

如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。

若不能

及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保留；非冷冻而易腐的食物,应置于4℃冰箱保留。

检

验前冷冻样品可于2～5℃18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。

　不同食品样品匀液的制备

4.2.1　液体食物

以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）,

以30cm幅度、于7s内振摇25次（或以机械振荡器振摇）,制成1:

10的样品匀液。

　固体和半固体食品

　　以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质

1～2min,制成1:

10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。

　稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递

增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。

从制备样品匀液至稀释完毕,全过程

不得超过15min。

5　大肠菌群的测定

　大肠菌群MPN值的测定

5.1.1　对每一个样品,选择适宜的三个持续稀释度的样品稀释液。

每一个稀释度接种三管月

桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤,每管接种1mL。

　将接种管置于36±1℃培育48±2h。

　观察试管的产气情况：

检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST

肉汤管数。

如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者,则进一

步作证实试验。

　大肠菌群的证明实验

5.2.1　将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。

　置BGLB肉汤管于36±1℃培育48±2h。

　记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

　结果报告：

按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B（补充件）]报告每克（毫升）样

品中大肠菌群的MPN值。

6　粪大肠菌群测定

　用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培育物移种于EC肉汤管中。

　将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖±0.5℃水浴箱内,培育24±2h。

水

浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。

应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不

产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

　记录EC肉汤管的产气情况。

产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群

试验阴性。

　结果报告：

按产气管数,查MPN表报告每克（毫升）样品中粪大肠菌群的MPN值。

7　大肠杆菌测定

　将条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）

平板,36±1℃培育24±2h。

检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

　如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平

板上至少挑取2个可疑菌落。

用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃

培育18～24h。

　将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。

7.4.1　色氨酸肉汤：

在36±1℃培育24±2h后,加Kovacs氏试剂～,上层显现红

色为靛基质阳性反应。

MR-VP培养基：

在36±1℃培育48±2h。

以无菌操作移取培育物1mL至13mm×100mm

试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液,40％氢氧化钾溶液和少量肌酸结晶,振摇试

管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。

　　将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。

如培养物变红色,为甲基

红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

Koser氏枸椽酸盐肉汤：

于36±1℃培育96h记录有无生长。

LST肉汤：

于36±1℃培育48±2h,观看试管中是不是产气。

　革兰氏染色：

取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。

大肠杆菌为革兰氏阴性。

　大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：

━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━

　　靛基质┃　　MR　　┃　　VP　　┃　枸椽酸盐┃鉴定（型别）

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━

　　　　＋　┃　　＋　　┃　　－　　┃　－　　　┃典型大肠杆菌

　　　　－　┃　　＋　　┃　　－　　┃　－　　　┃非典型大肠杆菌

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━

　　　　＋　┃　　＋　　┃　　－　　┃　＋　　　┃典型中间型

　　　　－　┃　　＋　　┃　　－　　┃　＋　　　┃非典型中间型

━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━

　　　　－　┃　　－　　┃　　＋　　┃　＋　　　┃典型产气肠杆菌

　　　　＋　┃　　－　　┃　　＋　　┃　＋　　　┃非典型产气肠杆菌

━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━

　　如显现上表之外的生化反映类型,说明培育物可能不纯,应从头划线分离,必要时做

重复试验。

　结果报告：

大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋

－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克（毫升）样品中大肠杆菌MPN

值。

8　大肠菌群固体培育基测定法

　样品制备同第4章。

　计数

8.2.1　选取适宜的三个持续稀释度的样品液,每一个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。

另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。

　将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）10～15mL倾注于每一个平皿中。

小

心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。

　待琼脂凝固后,再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。

　翻转平板,置于36±1℃培育18～24h。

　选用有30～150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。

典型菌落为

紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。

菌落直径为0.5mm或更大。

　证实

　从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内,36±

1℃培育24h和48h,观看产气情形。

　将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。

对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏

染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。

　结果报告

　　经最后证实为阳性（产气,革兰氏阴性杆菌）的试管百分比乘以于条中计数的平

板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克（毫升）样品中大肠菌群数。

　　例：

10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接

种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为：

　　100×6/10×10**4/g（mL）＝×10**5/g（mL）

附　录A　

　　　　　　　　　　　　　　培养基和试剂

　　　　　　　　　　　　　　　（补充件）

A1　月桂基硫酸盐胰蛋白（月示）（LST）肉汤

　　胰蛋白（月示）或胰酪胨（Trypticase）20g

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g

　　磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75g

　　月桂基硫酸钠0.1g

　　蒸馏水

　　将各成分溶解于蒸馏水中。

分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终±。

A2　煌绿乳糖胆盐（BGAB）肉汤

　　蛋白胨10.0g

　　乳糖　　　　10.0g

　　牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液

　　％煌绿水溶液

　　蒸馏水

　　将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于

200mL蒸馏水中,～,用蒸馏水稀释到975mL,调。

再加入％煌绿水溶

液,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管（管内有倒立

的小发酵管）中,每管10mL。

121℃高压灭菌15min。

最终±。

A3EC肉汤

　　胰蛋白（月示）或胰酪（月示）20.0g

　　3号胆盐或混合胆盐　　　　　　　　1.5g

　　乳糖　　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）4.0g

　　磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g

　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　蒸馏水

　　将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管（管内有倒立的小发酵管）,每管

8mL。

121℃高压灭菌15min,最终±。

A4　伊红美蓝琼脂（EMB）

　　蛋白胨10.0g

　　乳糖10.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0g

琼脂15.0g

　　伊红γ（水溶性）　　　　　　　　0.4g或2％水溶液20mL

　　美蓝　　　　　　　　　　　0.065g或％水溶液13mL

　　蒸馏水　　　　　　　　　　　　

　　在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。

分装于三角烧

瓶中。

每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。

最终±。

使用前将琼脂融化,于每

100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和的美蓝水

溶液,摇匀,冷至45～50℃倾注平皿。

A5　营养琼脂斜面

　　牛肉膏　　　　　　　　　　3.0g

　　蛋白胨　　　　　　　　　　5.0g

　　琼脂15.0g

　　蒸馏水

　　将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。

分装合适的试管。

121℃高压灭菌15min。

最终

±。

灭菌后摆成斜面备用。

A６　色氨酸肉汤

　　胰胨或胰酪胨10.0g

　　蒸馏水

　　加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。

分装试管,每管5mL。

121℃高压灭菌15min。

最终±。

A7MR-VP培育基

　　（月示）胨　　　　　　　　　　　　　7.0g

　　葡萄糖　　　　　　　　　　　　　5.0g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g

　　蒸馏水

　　将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终±。

A8Koser氏枸椽酸盐肉汤

　　磷酸氢铵钠（NaNH4HPO4·4H2O）　　　1.5g

　　磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0g

　　硫酸镁（MgSO4·7H2O）　　　　　　　0.2g

　　枸椽酸钠（含2H2O）　　　　　　　　　3.0g

　　蒸馏水

　　将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10mL,121℃高压灭菌15min。

最终

±。

A9　结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）

　　蛋白胨　　　　　　　7.0g

　　酵母膏　　　　　　　　3.0g

　　乳糖　　　　　　　　　10.0g

　　氯化钠　　　　　　　5.0g

胆盐或3号胆盐　　　1.5g

　　中性红　　　　　　　　0.03g

　　结晶紫　　　　　　　　0.002g

　　琼脂15～18g

　　蒸馏水　　　　　　　　

　　将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至±。

煮沸2min,将

培养基冷至45～50℃倾注平板。

临历时制备,不得超过3h。

A10Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液 

　　贮存液

　　磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g

　　蒸馏水500mL

　　将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠约175mL调至。

用蒸馏水加至

1000mL贮存于冰箱。

　　稀释液

　　取贮存液,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。

A11生理盐水

　　氯化钠　　　　　　　　　8.5g

　　蒸馏水 

　　将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。

A12革兰氏染色液

　　结晶紫染色液：

　　结晶紫　　　　　　　　1.0g

　　95％乙醇

　　1％草酸铵水溶液

　　将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

　　革兰氏碘液：

　　碘　　　　　　　　　　1.0g

　　碘化钾　　　　　　　　2.0g

　　蒸馏水

　　将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至

300mL。

　　沙黄复染液：

　　沙黄　　　　　　　　0.25g

　　95％乙醇

　　蒸馏水

　　将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。

　　染色法

　　a.将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。

　　b.　滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。

　　c.滴加95％乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。

　　d.　滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。

结果：

革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。

A13Kovacs氏靛基质试剂

　　对二甲氨基苯甲醛　　　　5.0g

　　戊醇

　　盐酸（浓）

　　将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。

A14甲基红指示剂

　　甲基红0.1g

　　95％乙醇300mL

　　将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。

A15Voges-Proskauer（V-P）试剂

　　甲液　

　　α-萘酚　　　　　　　　　5.0g

　　无水乙醇

　　乙液

　　氢氧化钾40.0g

　　用蒸馏水加至

　　　　　　　　　　　　　　　附　录B

　　　　　　　　　　　　1g检样中最近似值（MPN）表

　　　　　　　　　　　　　　　　（补充件）

使用三管法,接种量分别为,和0.001g。

━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━

阳性管数　　　┃　　　　┃　　　阳性管数　┃

━━━━━━━━━┫　MPN　┣━━━━━━━━━━┫MPN

　┃　　　　｜　　┃

━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━

　0　0　0　　　┃＜3　┃　2　0　0　　　　┃

　0　0　1　　　┃　3　┃　2　0　1　　　　┃14

　0　0　2　　　┃　6　┃　2　0　2　　　　┃20 

　0　0　3　　　┃　9　┃　2　0　3　　　　┃26 

　0　1　0　　　┃　3　┃　2　1　0　　　　┃15 

　0　1　1　　　┃　┃　2　1　1　　　　┃20 

　0　1　2　　　┃　┃　2　1　2　　　　┃27 

　0　1　3　　　┃　　12┃　2　1　3　　　　┃34 

　0　2　0　　　┃　┃　2　2　0　　　　┃21 

　0　2　1　　　┃　┃　2　2　1　　　　┃28 

　0　2　2　　　┃　12　┃　2　2　2　　　　┃35 

　0　2　3　　　┃　16　┃　2　2　3　　　　┃42 

　0　3　0　　　┃　┃　2　3　0　　　　┃29

　0　3　1　　　┃　13　┃　2　3　1　　　　┃36 

　0　3　2　　　┃　16　┃　2　3　2　　　　┃44 

　0　3　3　　　┃　19　┃　2　3　3　　　　┃53 

━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━

　1　0　0　　　┃　┃　3　0　0　　　┃23

　1　0　1　　　┃　┃　3　0　1　　　　┃39

　1　0　2　　　┃　11　┃　3　0　2　　　　┃64

　1　0　3　　　┃　15　┃　3　0　3　　　　┃95

　1　1　0　　　┃　┃　3　1　0　　　　┃43

　1　1　1　　　┃　11　┃　3　1　1　　　　┃75

　1　1　2　　　┃　15　┃　3　1　2　　　　┃120

　1　1　3　　　┃　19　┃　3　1　3　　　　┃160

　1　2　0　　　┃　11　┃　3　2　0　　　　┃93

　1　2　1　　　┃　15　┃　3　2　1　　　　┃150

　1　2　2　　　┃　20　┃　3　2　2　　　　┃210

　1　2　3　　　┃　24　┃　3　2　3　　　　┃290

　1　3　0　　　┃　16　┃　3　3　0　　　　┃240

　1　3　1　　　┃　20　┃　3　3　1　　　　┃460

　1　3　2　　　┃　24　┃　3　3　2　　　　┃1100

　1　3　3　　　┃　29　┃　3　3　3　　　　┃＞1100

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注:

①本表采纳3个稀释度[0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）],每一个稀释度接种3管。

　②表内所列检样量如改用1g（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）时,表内数字应相应降低10

倍；如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）和0.0001g（mL）时,那么表内数字应相应增加10倍,其余

类推。

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附加说明：

本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。

本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进

出口商品检验局负责起草。

本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。

本标准主要参考美国公职分析化学家协会（AOAC）法定分析方法第14版第46章（1984年）。

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中华人民共和国国家进出口商品查验局1992-12-28批准1993-05-01实施