RNA提取及组织匀浆.docx

1、RNA提取及组织匀浆1、取组织块（0.2g1g）最少可到25mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内2、2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4,0.01mol/L Tris-HCL, 0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8的氯化钠溶液）或者用0.86冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。3、3、匀浆的方式有多种：手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融

2、。4、手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使组织匀浆化。5、机器匀浆：用组织捣碎机1000015000r/min上下研磨制成10组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续35次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。6、超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生

3、仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复35次。7、反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。8、取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。9、4、将制备好的10匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心1015分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。10、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定TRIzol试剂适

4、用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNADNA蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。TRIzol试剂可用于小量样品（50100mg组织、5106细胞）也适用于大量样品（1g组织、107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同

5、样品，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern Blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNase处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于Western Blotting。 规格：100ml 黄色透明液体储存条件：28避光保存12个月注意：请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。 预防

6、RNase污染注意事项： 1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。 2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150烘烤4小时，塑料制品可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。 4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01v/v，放置过夜，高压灭菌注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。RNA的提取1. 匀浆处理：a.组织将组织在

7、液氮中磨碎，每50100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10。 b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。 c.细胞悬液离心收集细胞，每510106动物、植物、酵母细胞或1107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2.将匀浆样品在室温（1530）放置5分钟，使

8、核酸蛋白复合物完全分离。3.可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2810000g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5. 2-810000g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作

9、见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。7. 2810000g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8. 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75乙醇。28不超过7500g离心5分钟，弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾510分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25200l无RNase的水或0.5SDS，用枪头吸打几次，5560放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离

10、子甲酰胺溶解，-70保存。注意事项： 1.从少量样品（110mg组织或102104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加510gRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中28一星期以上或-5至-20一年以上。 3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600g离心3060分钟。预期产量：1mg组织或1106细胞提取RNA分别为： 肝和脾610g ，肾34

11、g ，骨骼肌和脑组织11.5g ，胎盘14g ，上皮细胞815g ，成纤维细胞57g 。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A28012000g离心10分钟除去。 DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。一单位A260值相当于50g/ml双链DNA。根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠1106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1g，6.5g，5.8g。预期产量：1mg组织或1106细胞提取DNA分别为肝和肾34g 骨骼肌，脑组织，胎盘23g 人，大鼠，小鼠培养细胞（1106）57g 成纤维细胞57g。应用：1.用于

12、PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES调pH至8.4，取0.11g DNA用作模板。 2.酶切反应用HEPES或1mM EDTA调节pH至适当值。每g DNA使用35单位的酶，8090%的DNA是可消化的。 1ml 8mM NaOH溶解的DNA样品pH值调节Final pH 0.1M HEPES（l） Final pH 1M HEPES（l） 8.4 86 7.2 23 8.2 93 7.0 32 8.0 101 7.8 117 7.5 159注意事项： 1. DNA在中间层和有机相中时可在28保存过夜。 2.DNA沉淀在75%乙醇中28可保存几个月。 3.DNA在8mM

13、NaOH溶液中4可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至78并且加EDTA至1mM，可置于4或-20长期保存。常见问题分析：得率低：A.样品匀浆和裂解的不彻底。B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。A260/A2801.70 ：A. 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。DNA降解：A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。RNA污染：A.氯仿分层后水相去除的不干净。B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含1

14、0%乙醇）洗的不彻底。蛋白质的提取准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。操作步骤：1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2812000g离心10分钟弃上清。2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，287500g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。3.真空抽干蛋白质沉淀510分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50温浴使其完全溶解，不溶物2810000g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot或-5至-20保存备用。注意事项： 1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中28一个月以上或-5至-20一年以上。 2.用0.1% SDS在28透析三次，10000g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。常见问题分析：得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。