RNA提取及组织匀浆.docx

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RNA提取及组织匀浆

1、取组织块（0.2g~1g）最少可到2～5mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内

2、2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph7.4,0.01mol/LTris-HCL,0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8％的氯化钠溶液）或者用0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。

3、3、匀浆的方式有多种：

手工匀浆、机器匀浆、超声匀浆、反复冻融。

4、手工匀浆：

将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

5、机器匀浆：

用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

6、超声粉碎：

用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

7、反复冻融：

培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。

8、取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间或增加冻融次数。

9、4、将制备好的10％匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10～15分钟，若检测ATP酶，则只需要1000转/分，离心5分钟，将离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。

10、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定

TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。

TRIzol试剂有多组分分离作用，与其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、盐酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。

取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。

TRIzol试剂可用于小量样品（50～100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。

对人，动物，植物组织，细菌均适用，可同时处理大量不同样品，整个提取过程在一小时内即可完成。

分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于NorthernBlot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。

在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。

共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。

蛋白质可用于WesternBlotting。

　　规格：

100ml黄色透明液体

　　储存条件：

2～8℃避光保存12个月

　　注意：

请勿直接接触皮肤或吞咽，以免灼伤。

如接触皮肤应立即用洗涤剂和大量水冲洗。

忌用乙醇擦洗，乙醇会加重灼伤程度。

　　预防RNase污染注意事项：

　　1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。

　　2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。

　　3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。

　　4.配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌

注：

DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。

RNA的提取

1.匀浆处理：

　　a.组织将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

　　b.单层培养细胞　直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积（即3.5cm直径的培养板）加1ml，用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

　　c.细胞悬液离心收集细胞，每5～10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2.将匀浆样品在室温（15～30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤：

如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2～8℃10000×g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5.2-8℃10000×g离心15分钟。

样品分为三层：

底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

6.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

7.2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

8.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。

2～8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5～10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。

加入25～200μl无RNase的水或0.5℅SDS，用枪头吸打几次，55～60℃放置10分钟使RNA溶解。

如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。

RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项：

　　1.从少量样品（1～10mg组织或102～104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。

例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5～10μgRNase-free糖原。

糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

　　2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。

RNA沉淀可以保存于75%酒精中2～8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

　　3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30～60分钟。

预期产量：

1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

　　肝和脾6～10μg，肾3～4μg，骨骼肌和脑组织1～1.5μg，胎盘1～4μg，上皮细胞8～15μg，成纤维细胞5～7μg。

常见问题分析：

得率低：

　　A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

　　B.RNA沉淀未完全溶解。

A260/A280<1.65：

　　A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。

低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高。

　　B.样品匀浆时加的试剂量太少。

　　C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。

　　D.吸取水相时混入了有机相。

　　E.RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：

　　A.组织取出后没有马上处理或冷冻。

　　B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

　　C.细胞在用胰酶处理时过度。

　　D.溶液或离心管未经RNase去除处理。

　　E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。

DNA污染：

　　A.样品匀浆时加的试剂量太少。

　　B.样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液。

蛋白聚糖和多糖污染：

　　沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl）混合离心，按之前操作进行。

这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。

从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。

DNA的分离

准备试剂：

乙醇0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）75%乙醇8mMNaOH

操作步骤：

1.样品加氯仿分层后，移去上层水相，用乙醇沉淀中间层和有机相中的DNA。

每使用1mlTRIzol加0.3ml无水乙醇混匀，室温放置3分钟，2～8℃不超过2000×g离心5分钟。

　　2.移去上清，（如需分离蛋白质，可保留，进一步操作见后）用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀。

每用1mlTRIzol加入1ml柠檬酸钠，室温放置30分钟，2～8℃2000×g离心5分钟，弃上清，重复一次。

　　3.用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1mlTRIzol加入1.5～2ml75%乙醇，室温放置10～20分钟（不时颠倒混合）2～8℃2000×g离心5分钟，弃上清。

　　4.室温放置晾干DNA5～15分钟，用8mMNaOH溶解DNA。

从50～70mg组织或107细胞中分离的DNA溶于300～600μl8mMNaOH，DNA的浓度通常为0.2～0.3μg/μl。

提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris缓冲液中，建议用弱碱溶解，8mMNaOH的pH值为9，溶解DNA后可用TE，HEPES调节pH。

从某些样品（尤其是组织）中提取的DNA中可能包含一些胶状不溶物可>12000×g离心10分钟除去。

DNA的定量：

取一份溶于8mMNaOH的DNA加水测A260值。

一单位A260值相当于50μg/ml双链DNA。

根据DNA产量可估计细胞数，人、大鼠、小鼠1×106二倍体细胞含DNA的量分别为7.1μg，6.5μg，5.8μg。

预期产量：

1mg组织或1×106细胞提取DNA分别为肝和肾3～4μg骨骼肌，脑组织，胎盘2～3μg人，大鼠，小鼠培养细胞（1×106）5～7μg成纤维细胞5～7μg。

应用：

　　1.用于PCR溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES调pH至8.4，取0.1～1μgDNA用作模板。

　　2.酶切反应用HEPES或1mMEDTA调节pH至适当值。

每μgDNA使用3～5单位的酶，80～90%的DNA是可消化的。

　　1ml8mMNaOH溶解的DNA样品pH值调节

　　FinalpH0.1MHEPES（μl）FinalpH1MHEPES（μl）

　　8.4867.223

　　8.2937.032

　　8.0101

　　7.8117

　　7.5159

注意事项：

　　1.DNA在中间层和有机相中时可在2～8℃保存过夜。

　　2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存几个月。

　　3.DNA在8mMNaOH溶液中4℃可放置过夜，如长期保存需用HEPES调节pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃长期保存。

常见问题分析：

得率低：

　　A.样品匀浆和裂解的不彻底。

　　B.最终得到的DNA沉淀没有完全溶解。

A260/A280<1.70：

　　A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。

　　B.酚除去的不彻底，可用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。

DNA降解：

　　A.组织取出后没有马上处理或冷冻。

　　B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。

　　C.样品匀浆时使用了高速匀浆仪。

RNA污染：

　　A.氯仿分层后水相去除的不干净。

　　B.DNA沉淀用0.1M柠檬酸钠（含10%乙醇）洗的不彻底。

蛋白质的提取

准备试剂：

异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。

操作步骤：

1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。

每使用1mlTRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。

每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。

用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。

分离得到的蛋白质样品可用于WesternBlot或-5至-20℃保存备用。

注意事项：

　　1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2～8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。

　　2.用0.1%SDS在2～8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于WesternBlot。

常见问题分析：

得率低：

　　A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

　　B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。

蛋白质降解：

组织取出后没有马上处理或冷冻。

电泳时条带变形：

蛋白质沉淀洗涤不充分。