鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接cropped.docx

1、鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接cropped鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接_croppedC N 53 - 1040/ Q ISS N 0254 - 5853 动 物 学 研 究 2006 , Apr . 27 ( 2) : 175 - 180 Zoological Researc h 鸡 Z 染色体上 DM R T1 基因的多重跨染色体剪接 3 3 凯 , 程汉华 , 周荣家 赵 洋 , 余红仕 , 卢 衡 , 姚 ( )武汉大学 生命科学学院 发育生物学研究中心 , 湖北 武汉 430072 () 摘要 : 性别决定与分化发育是同时涉及生命现象中两种细胞分裂 有

2、丝分裂和减数分裂形式的惟一的分 化发育过程 。对该过程中关键基因 DM R T1 的转录分析 , 发现位于鸡 Z 染色体上的 DM R T1 基因分别同时与 4 号 染色体上的 C EN P C1 基因 、5 号染色体上 CD5R 基因和 2 号染色体上 37L R P/ p40 基因发生跨染色体剪接 , 由 此构成了新的跨染色体剪接本 DM R T12 C EN P C1 、DM R T12 CD5R 和 DM R T12 37L R P/ p40 。对其剪接位点的分析 , 发现两段染色体序列存在的重叠区可能在这种剪接中起着重要作用 。DM R T1 基因在转录过程中同时与多个染 色体上基因

3、发生多次跨染色体剪接的发现 , 无疑有助于对在转录水平上的多样性基因调控以及性别决定与分化 发育等的认识开辟另一新途径 。 关键词 : 性别决定 ; Z 染色体 ; 转录 ; 鸡 () 中图分类号 : S83112 ; Q343 文献标识码 : A 文章编号 : 0254 - 5853 200602 - 0175 - 06 Interchromosomal Tra ns2Spl icing of DM R T1 Gene on Chicken Chromosome Z 3 3ZHAO Ya n g , YU Ho n g2s hi , LU He n g , YAO Kai , CHEN G

4、Ha n2h ua , ZHOU Ro n g2jia ()Department of Genetics and Center f or Development al B iology , College of L if e Sciences , Wuhan University , Wuhan 430072 , Chi na Abstract : Sex determination/ differentiation i s the only developmental p rocess involving two types of cell divi sions ( ) mitosi s a

5、nd meiosi s. Analysi s of transcription of key gene DM R T1 in the p rocess showed that DM R T1 gene on the chro2 mosome Z was trans2spliced with C EN P C1 on the chromosome 4 , CD 5R on the chromosome 5 and 37L R P/ p40 on the chromosome 2 , which composed a rare form of transcript s DM R T12 C EN

6、P C1 , DM R T12 CD 5R and DM R T12 37L R P/ p40 respectively. Overlapping regions between splicing sites on both chromosomes were observed , which would play an impor2 tant role in the interchromosomal trans2splicing. The findings that multiple genes on different chromosomes are trans2 spliced simul

7、taneously with the DM R T1 during transcription undoubtedly help in understanding diversity of gene regula2 tions at transcriptional level and sex determination and differentiation mechani sms . Key wor ds : Sex determination ; Chromosome Z ; Transcription ; Chicken 人类基因组计划结果 显 示 , 人 类 的 基 因 约 为 , 这

8、些蛋白可以具有多样性的生物学功能 , 有些 白 25 000 多个 , 比原先预计的 10 万个基因相差甚远 。 相互之间甚至具有相反的颉抗作用 。人类基因组中59 %的基 因 具 有 选 择 性 剪 接 , 一 个 基 因 产 生 多 个人类等高度物种基因组的复杂性与基因数量的关系 提示 , 存在其他机制来增加基因组的复杂性 , 以适 mRNAs , 其中约 80 %的选择性剪接导致编码的蛋 ( 应多变的环境和高度的智力等生理需求 。目前的研 白质 改 变 International Human Genome Sequencing ) 究显示 , 选择性剪接是增加基因组编码能力的重要 Con

9、sortium , 2001 ; Modrek & Lee , 2002。通 过 选机制 。选择性剪接是通过对 mRNA 前体分子中不同 择性剪接方式大大增加了基因组的编码能力和蛋白 质的多 样 性 。选 择 性 剪 接 大 致 可 以 划 分 为 三 类 : 5和 3剪接位点的拼接 , 使一个基因能编码多个蛋 收稿日期 : 2005 - 12 - 07 ; 接受日期 : 2006 - 01 - 04 () ( ) 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 30370771; 国家重点基础研究发展规划项目 2004CB117401; 教育部新世纪人才计划资 助 3 ( ) 通讯作者 Coress

10、ponding authors, E2mail : rjzhou whu1edu1cn ; hhcheng whu1edu1cn() 1选择性启动子 , 多个第一个外显子的选择 , 将 平上的多样性基因调控以及性别决定与分化发育等 ( ) 的认识 。使 mRNAs 的 5端具有多样性 ; 2mRNAs 前体分 子内部外显子的选择性剪接 , 包括内含子引入 , 外 1 材料和方法 ( ) 显子的切除 ; 3mRNAs 前体分子 3末端外显子 的选择性剪接 , 将利用不同的 3末端的加尾信号 , 111 实验材料 产生不同的 3UTR mRNA 分子或者具有不同 C 末 本实验所用来杭鸡购于华中农

11、业大学鸡场 , 为 端的蛋白质分子 。 成年雄性个体 。 我们最近发现 , 参与性别分化发育的基因 DM2 112 RNA 提取及 cD NA 合成R T1 在性腺中存在选择性剪接 。在人类 、小鼠 、黄 取雄性个体性腺 , 液氮研磨 , 依说明书提取总 ( ) 鳝 、斑马鱼等物种中均存在类似于果蝇性别决定基 RNA Qiagen Total RNA Kit , Rnase2free Dnase ( ) ( ) 因 doublesex dsx 的选择性剪接模式 , 即选择性 Promega 消 化 和 纯 化 后 , 用 1 g 为 模 板 合 成 ( ( 剪接都发生在基因 3端 Guo et

12、 al , 2005 ; Huang SMART cDNA Clontech SMART cDNA Synthesis ) ) et al , 2005Kit 。Dsx 基因选择性剪接在果蝇的性别决 。 定中起着重要作用 。果蝇 dsx 和线虫的性别决定基 113 3RACE 扩增因 m ab2 3 所 编 码 的 蛋 白 质 都 包 含 一 个 新 的 具 有 以 SMART cDNA 为模板 , 引物为 : CDS ?: 5 30( ) DNA 结合能力的保守基序 , 即 DM 结构域 , 并由此 ATTCTA GA GGCCGA GGCGGCCGACATG TNN 3( ) 通过相似的机

13、制控制性别的分化发育 。最近的研究 SMART cDNAs 公 有 引 物 , gDMF1 : 5GCAAC2 ( 显示 , 在哺乳动物 、鸟类 、爬行类 、线虫以及果蝇 CACGGCTACTCCTCGC 3 DM R T1 特 异 引 物 , 位 ( ) 中 都 发 现 了 包 含 有 DM 结 构 域 的 基 因 Shen & 于 DM 结构域 , 紧靠其 5端。反应混合物总体积 ( ) 20L , 包 括 10 mmol / L 、Tris2HCl p H 813 、115Hodgkin , 1988 ; Raymond et al , 1998 ; Raymond et ) al ,

14、1999 ; Smith et al , 1999, 该基因形成了一个 mmol/ L MgCl、50 mmol / L KCl 、200mol / L dNTP 、 2 新的控制发育的基因家族 。这类基因具有高度的进 每种引物 012mol / L 、1 U Tag DNA 聚合酶 。PCR ( 扩增条件 : 94 ?变性 3 min ; 然后 94 ?变性 20 s ,化保 守 性 , 被 统 称 为 DM R T 基 因 doublesex 和 ) m ab3 相关的转录因子。目前 , 已经发现 DM R T 基 复性从 68 ?到 60 ? 30 s , 每个循环降 015 ?, 72

15、因家族至少具有 7 个成员基因 。Dm rt 1 是第一个在 ?延伸 90 s , 8 个循环 ; 之后 , 94 ?变性 20 s , 61小鼠及人类中克隆得到的包含 DM 结构域的基因 , ?复性 30 s , 72 ?延伸 90 s , 30 个循环 ; 最后 72( Raymond et al , 并证 实 参 与 了 性 别 的 分 化 发 育 ?延伸 7 min 。) 114 阳性克隆鉴定1998。 ( ) 反式剪接 tans2splicing是一种稀有的剪接形 E3dp hRACE PCR 产物纯化后 1Z1N1A Cycle2( ) ) 式 , 它是将相互两条独立基因表达的 m

16、RNA 连接成 Pure Kit 与 p GEM2T Easy 载 体 Promega 连 接 , 电转至 TG1 中 , 挑单克隆 , 菌落 PCR 鉴 定 。PCR为一个新的转录本 , 最近在线虫 、果蝇 、大鼠等物种中都存在这种剪接方式 , 其中多为来自于同一染 扩增引物 : CDS ?:ATTCTA GA G GCCGA GGCGGC230 ( ) ( 色体 mRNA 之间的剪接 Sullivan et al , 1991 ; Blu2 CGACATG TNN 3, gDMF2 : 5GCTGAA GCT2) GAA GGGGCACAA GCGGTT 3。反应体系同 3RACE men

17、thal , 1995, 仅有几例是涉及两个不同染色体 ( 上 mRNA 的 剪 接 Sullivan et al , 1991 ; Vellard et PCR 。PCR 扩增条件 : 94 ?变性 3 min ; 然后 94 ? ) al , 1991 ; Li et al , 1999 ; Yang et al , 2004。这种 变性 25 s , 65 ?复性 30 s , 72 ?延伸 90 s , 35 个循环 , 最后 72 ?延伸 7 min , 涉及两个不同染色体上 mRNA 的剪接 , 即跨染色体 () 剪接 interchromosomal trans2splicing

18、是一类特殊 的Southern 杂交 : 探针为黄鳝的 Dm rt 1 全长 cD2( ) 反式剪接 , 其分子机制及生物功能仍不清楚 。 NA 1148 kb , GenBank 登 录 号 为 AF421347, 以本研究首次发现鸡 DM R T1 的 跨 染 色 体 剪 接 , 插入黄鳝 Dm rt 1 全长 cDNA 的质粒为模板 , PCR 扩 ( 并且与多个染色体上基因发生多次剪接 , 我们称其 增 , 切 胶 回 收 扩 增 片 段 E1Z1N1 Gel Extraction) ( 为 多 重 跨 染 色 体 剪 接 multiple interchromosomal Kit 。

19、扩 增 探 针 引 物 : 5f 2 : 5GTTTGGCA GTTG2) trans2splicing。这些新发现无疑有助于对在转录水 GCA GCA TA GT 3, 1 500 r : 5A GTTTGATTCTGAA2GA GTGCCCC 3。将克隆 PCR 产物电泳转膜 , 紫外 后的序列分别是另外 3 个染色体上基因的跨染色体 2 ( ) 胶联仪胶联 2 min 12 000 J / cm。55 ?预杂交 2 剪接 , 它 们 分 别 是 DM R T1 与 4 号 染 色 体 上 的32h , 2p 标记的探针加入杂交管中于 55 ?杂交 16 ( ) C EN P C1 基因

20、GenBank 登录号 nm205051、5 号 h 。依 次 用 2 SSC 、015 % SDS ; 2 SSC 、011 % ( 染色体上 CD 5R 基因 预测基因 , 与 CD 5 基因相 ) 洗膜 , 最后用 011 SSC 、011 % ? SDS 于 55 关 , GenBank 登 录 号 hmm8859和 2 号 染 色 体 上SDS ( ) 37L R P/ p40 GenBank 登 录 号 xm418817 基 因 ,洗膜 。X 射线曝光及显影 。115 序列测序与分析由此构成了新的跨染色体剪接本 , 分别命名为 DM2DNA 序列委托上海博亚公司测序 ,cDNA 序

21、列 R T12 C EN P C1 、 DM R T12 CD 5R 、 DM R T12 37L R P/( p40 GenBank 登 录 号 分 别 为 A Y448020 、 在 NCB I 进行 Blast 分析 , 查询与其相似的核苷酸序 ) ( )A Y448021 、A Y448022。 上 列 , 并 在 UCSC http : www1genome1ucsc1edu 利用 Blat 与鸡基因组序列进行比对分析 。DM R T2 C EN P C1 含有 4 个外显子 , 最后一个 外显子是 4 号染色体上着丝粒蛋白 C EN P C1 基因 2 结果与分析 的外显子 19

22、, 也是 C EN P C1 基因的 3UTR 。DM2 R T12 CD 5R 基因含有 7 个外显子 , 外显子 4 、5 、6 、 211 鸡 D M R T1 3RACE 分析 7 来自 5 号染色体上 CD 5R 基因 。DM R T12 37L R P/ 3RACE 分析获得 920 、860 和 810 bp 的 DNA( 片 段 , 经 DM R T1 探 针 Southern 杂 交 为 阳 性 图p40 基因含有 6 个外显子 , 后 4 个外显子位于 2 号 ) ( 1。经 DNA 序列测序和分析 , 与已报道的鸡 DM2染色体上 , 与 37L R P/ p40 基因

23、核纤受体前体蛋 ) () R T1 基因 mRNA AF123456进行比对分析 , 发现 白/ p40 核糖体关联蛋白基因相互剪接 。这 3 个克隆都包含 DM R T1 的保守区域 DM 区 , 但 对 3 个剪接本翻译的氨基酸序列进行分析 , 发 现其开 放 阅 读 框 与 DM R T1 基 因 的 开 放 阅 读 框 一 3端序列在 DM R T1 基因中并不存在 。对鸡基因组进行 Blast 分析 , 发现存在选择性剪接 。DM R T1 基 致 。DM R T12 C EN P C1 基因编码 232 个氨基酸 , 含 因含有 5 个外显子 , 与之比较 , 3 个剪接本都有外

24、有 DM R T1 基因的 DM 区 , 来自于 C EN P C1 基因的 显子 1 和 2 , 但是缺少外显子 4 和 5 。在 3 个剪接 225 个碱基仅提供 19 个氨基酸的编码序列 , 其余为 3UTR 。DM R T12 CD 5R 基因编码 239 个氨基酸 , 本中第一个剪接本含有完整的外显子 3 ; 第二个剪含DM 区 , 来 自 于 CD 5 R 基 因 的 序 列 为 CD 5 相 关 的 第三个剪接 接本含有外显子 3 前面的 34 个碱基 ; 一个转录本 , 该转录本由于其选择性剪接与 CDR 本完全不含外显子 3 。其他转录本部分区段存在差异 , 导致 3端读码框

25、出 212 鸡 D M R T1 存在跨染色体剪接发现这三个剪 与鸡基因组序列进行比对分析 , 现变 化 , 而 与 DM R T1 拼 接 后 读 码 框 一 致 。 DM2 () 接本存在跨染色体剪接 图 2。在 DM R T1 序列之 R T 12 3 7L R P/ p 4 0 基因编码259个氨基酸 ,含 DM R T 1图 1 鸡 DM R T1 3RACE 分析 Fig. 1 3RACE analysis of chicken DMR T1() A : 克隆 PCR 产物 ; B : PCR 产物的 Southern 杂交结果 A : Clone PCR products ; B

26、 : Southern blot hybridization of PCR products。 1 : DMR T2 C EN P C1 ; 2 : DMR T12 CD5R ; 3 : DMR T1237L R P/ p40 ; 4 : Lambda DNA/ Hi n d ?+ EcoR ?marker .图 2 DM R T2 C EN P C1 、DM R T12 CD 5R 、DM R T12 37L R P/ p40 的跨染色体分析 Fig. 2 Interchromosomal trans2splicing analysi s of DM R T2 C EN P C1 , DM

27、R T12 CD 5R , DM R T12 37L R P/ p40 ( () ) ) 因目前鸡 DMR T1 mRNA 的 5序列未到起始密码子 ATG , 依据人 CAB8242711、小鼠 AAF1282611、大鼠 AA K5770611、 () 猪 AAL 25080的 DMR T1 蛋白质序列 , 并假定鸡 DMR T1 5端不存在选择性剪接 , 预测了鸡 DMR T1 mRNA 5序列 , 将序列补至 ATG。Because of unknown 5sequence to start code ATG of DMR T1 mRNA , we deduced the 5seque

28、nce of chicken DMR T1 according to amino acid () () () sequences of mouse AAF1282 611, rat AA K5770611, pig AAL 25080, and supposed that no alternative splicing at 5region of chick2 en DMR T1 . DM 区 , 其余氨基酸序列与 37L R P/ p40 基因一致 , , DM R T2 C EN P C1 形成单股茎环结构 , DM R T12 构 包括 37L R P/ p40 基因的回文序列 LMWW

29、ML , 该回 CD 5R 和 DM R T12 37L R P/ p40 形成双股茎环结构 。( 文序列 是 核 纤 蛋 白 受 体 ?的 结 合 位 点 Clausse et 3 讨论 ) al , 1996 。 DM R T12 C EN P C1 、 DM R T12 CD 5R 以TGA 为 终 止 密 码 子 , DM R T12 37L R P/ p40 则 采 用 DM R T1/ dsx / m ab2 3 是惟一参与脊椎动物和非 () TAA 表 1; DM R T12 C EN P C1 和 DM R T12 37L R P/ 脊椎动物性别决定与分化发育的共有基因 , 它

30、们均p40 含有 AATAAA 加尾信号 , DM R T12 CD 5 没有此 具有共同的 DM 结构域 。目前已在哺乳类 、鸟类 、 ( 序列 , 可 能 存 在 其 他 序 列 起 加 尾 信 号 的 作 用 图 爬行类两栖类和鱼类等进化地位不同的物种中都发 ) 3。DM R T12 CD 5R 中两段染色体序列相剪接 的 附 现了该类基因 。已知果蝇 dsx 基因的 3端选择性剪 近序 列 存 在 8 个 碱 基 重 叠 , 即 CCATCCCC , DM2 接参与其性别分化 , 最近我们在小鼠 、黄鳝 、斑马 R T1237L R P/ p40 中存在 7 个碱基重叠 , 即 TGA

31、 GC2鱼 DM R T1 中发现的选择性剪接方式与果蝇 dsx 基 ( ) 因类似 Guo et al , 2005 ; Huang et al , 2005, 表 CA 。明这种剪接在进化上是保守的 , 可能在性别决定和 213 鸡 D M R T1 跨染色体剪接位点分析( 分 化 机 制 中 具 有 重 要 的 作 用 Burtis & Baker , 对这些剪接本的跨染色体剪接位点进行分析 ,) 1989。性腺的形成与分化是同时涉及生命现象中 发现 DM R T12 C EN P C1 和 DM R T12 37L R P/ p40 均符 两 种细胞分裂形式的惟一发育过程 ,即有丝分裂

32、和 合 GU2A G 规律 , DM R T12 CD 5R 是 AT2CC , 也不符 减数分裂 , 相对其他生命过程 , 其分化发育中的基 因表达调控具有独特的复杂性 。 合少见的 GC2A G , AT2AC , 可能是稀有的跨染色体 ( ) 本研究发现鸡 DM R T1 存在跨染色体剪接 , 并 剪接方式 表 1。对跨染色体剪接位点附近的 34 bp 序列进行分析 , 发现它们的序列不具有保守性 。且分别与另外3个染色体的3个不同基因之间发生 () 用 RNAStructure Mathews et al , 1999预测二级结表 1 鸡 D M R T1 及其跨染色体剪接位点分析 Ta b. 1 Spl icing sites analysis of c hic ken D M R T1 an d interc hromosomal t r a ns2spl ice d isof or ms 剪接位点 Splic