鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接cropped.docx
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鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接cropped
鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接_cropped
CN53-1040/QISSN0254-5853动物学研究2006,Apr.27
（2）:
175-
180
ZoologicalResearch
Ξ鸡Z染色体上DMRT1基因的多重跨染色体剪接
33凯,程汉华,周荣家赵洋,余红仕,卢衡,姚
（）武汉大学生命科学学院发育生物学研究中心,湖北武汉430072
（）摘要:
性别决定与分化发育是同时涉及生命现象中两种细胞分裂有丝分裂和减数分裂形式的惟一的分化发育过程。
对该过程中关键基因DMRT1的转录分析,发现位于鸡Z染色体上的DMRT1基因分别同时与4号染色体上的CENPC1基因、5号染色体上CD5R基因和2号染色体上37LRP/p40基因发生跨染色体剪接,由此构成了新的跨染色体剪接本DMRT12CENPC1、DMRT12CD5R和DMRT1237LRP/p40。
对其剪接位点的分析,发现两段染色体序列存在的重叠区可能在这种剪接中起着重要作用。
DMRT1基因在转录过程中同时与多个染色体上基因发生多次跨染色体剪接的发现,无疑有助于对在转录水平上的多样性基因调控以及性别决定与分化发育等的认识开辟另一新途径。
关键词:
性别决定;Z染色体;转录;鸡
（）中图分类号:
S83112;Q343文献标识码:
A文章编号:
0254-5853200602-0175-06
InterchromosomalTrans2SplicingofDMRT1
GeneonChickenChromosomeZ
33ZHAOYang,YUHong2shi,LUHeng,YAOKai,CHENGHan2hua,ZHOURong2jia
（）DepartmentofGeneticsandCenterforDevelopmentalBiology,CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China
Abstract:
Sexdetermination/differentiationistheonlydevelopmentalprocessinvolvingtwotypesofcelldivisions（）mitosisandmeiosis.AnalysisoftranscriptionofkeygeneDMRT1intheprocessshowedthatDMRT1geneonthechro2mosomeZwastrans2splicedwithCENPC1onthechromosome4,CD5Ronthechromosome5and37LRP/p40onthechromosome2,whichcomposedarareformoftranscriptsDMRT12CENPC1,DMRT12CD5RandDMRT1237LRP/p40respectively.Overlappingregionsbetweensplicingsitesonbothchromosomeswereobserved,whichwouldplayanimpor2tantroleintheinterchromosomaltrans2splicing.Thefindingsthatmultiplegenesondifferentchromosomesaretrans2splicedsimultaneouslywiththeDMRT1duringtranscriptionundoubtedlyhelpinunderstandingdiversityofgeneregula2tionsattranscriptionallevelandsexdeterminationanddifferentiationmechanisms.Keywords:
Sexdetermination;ChromosomeZ;Transcription;Chicken
人类基因组计划结果显示,人类的基因约为,这些蛋白可以具有多样性的生物学功能,有些白
25000多个,比原先预计的10万个基因相差甚远。
相互之间甚至具有相反的颉抗作用。
人类基因组中
59%的基因具有选择性剪接,一个基因产生多个人类等高度物种基因组的复杂性与基因数量的关系
提示,存在其他机制来增加基因组的复杂性,以适mRNAs,其中约80%的选择性剪接导致编码的蛋
（应多变的环境和高度的智力等生理需求。
目前的研白质改变InternationalHumanGenomeSequencing
）究显示,选择性剪接是增加基因组编码能力的重要Consortium,2001;Modrek&Lee,2002。
通过选机制。
选择性剪接是通过对mRNA前体分子中不同择性剪接方式大大增加了基因组的编码能力和蛋白
质的多样性。
选择性剪接大致可以划分为三类:
5′和3′剪接位点的拼接,使一个基因能编码多个蛋
Ξ收稿日期:
2005-12-07;接受日期:
2006-01-04
（）（）基金项目:
国家自然科学基金资助项目30370771;国家重点基础研究发展规划项目2004CB117401;教育部新世纪人才计划资
助3（）通讯作者Coresspondingauthors,E2mail:
rjzhou@whu1edu1cn;hhcheng@whu1edu1cn
（）1选择性启动子,多个第一个外显子的选择,将平上的多样性基因调控以及性别决定与分化发育等
（）的认识。
使mRNAs的5′端具有多样性;2mRNAs前体分
子内部外显子的选择性剪接,包括内含子引入,外1材料和方法（）显子的切除;3mRNAs前体分子3′末端外显子
的选择性剪接,将利用不同的3′末端的加尾信号,111实验材料
产生不同的3′UTRmRNA分子或者具有不同C末本实验所用来杭鸡购于华中农业大学鸡场,为端的蛋白质分子。
成年雄性个体。
我们最近发现,参与性别分化发育的基因DM2112RNA提取及cDNA合成
RT1在性腺中存在选择性剪接。
在人类、小鼠、黄取雄性个体性腺,液氮研磨,依说明书提取总
（）鳝、斑马鱼等物种中均存在类似于果蝇性别决定基RNAQiagenTotalRNAKit,Rnase2freeDnase
（）（）μ因doublesexdsx的选择性剪接模式,即选择性Promega消化和纯化后,用1g为模板合成
（（剪接都发生在基因3′端Guoetal,2005;HuangSMARTcDNAClontechSMARTcDNASynthesis
））etal,2005Kit。
Dsx基因选择性剪接在果蝇的性别决。
定中起着重要作用。
果蝇dsx和线虫的性别决定基1133′RACE扩增
因mab23所编码的蛋白质都包含一个新的具有以SMARTcDNA为模板,引物为:
CDS?
:
5′
30（）DNA结合能力的保守基序,即DM结构域,并由此ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGTNN3′
（）通过相似的机制控制性别的分化发育。
最近的研究SMARTcDNAs公有引物,gDMF1:
5′GCAAC2
（显示,在哺乳动物、鸟类、爬行类、线虫以及果蝇CACGGCTACTCCTCGC3′DMRT1特异引物,位
（）中都发现了包含有DM结构域的基因Shen&于DM结构域,紧靠其5′端。
反应混合物总体积
μ（）20L,包括10mmol/L、Tris2HClpH813、115Hodgkin,1988;Raymondetal,1998;Raymondet
）μal,1999;Smithetal,1999,该基因形成了一个mmol/LMgCl、50mmol/LKCl、200mol/LdNTP、2
μ新的控制发育的基因家族。
这类基因具有高度的进每种引物012mol/L、1UTagDNA聚合酶。
PCR
（扩增条件:
94?
变性3min;然后94?
变性20s,化保守性,被统称为DMRT基因doublesex和
）mab3相关的转录因子。
目前,已经发现DMRT基复性从68?
到60?
30s,每个循环降015?
72
因家族至少具有7个成员基因。
Dmrt1是第一个在?
延伸90s,8个循环;之后,94?
变性20s,61
小鼠及人类中克隆得到的包含DM结构域的基因,?
复性30s,72?
延伸90s,30个循环;最后72
（Raymondetal,并证实参与了性别的分化发育?
延伸7min。
）114阳性克隆鉴定1998。
（（）反式剪接tans2splicing是一种稀有的剪接形E3dphRACEPCR产物纯化后1Z1N1ACycle2
（））式,它是将相互两条独立基因表达的mRNA连接成PureKit与pGEM2TEasy载体Promega连接,
电转至TG1中,挑单克隆,菌落PCR鉴定。
PCR为一个新的转录本,最近在线虫、果蝇、大鼠等物
种中都存在这种剪接方式,其中多为来自于同一染扩增引物:
CDS?
:
′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGC2
30（）（色体mRNA之间的剪接Sullivanetal,1991;Blu2CGACATGTNN3′,gDMF2:
5′GCTGAAGCT2
）GAAGGGGCACAAGCGGTT3′。
反应体系同3′RACEmenthal,1995,仅有几例是涉及两个不同染色体
（上mRNA的剪接Sullivanetal,1991;VellardetPCR。
PCR扩增条件:
94?
变性3min;然后94?
）al,1991;Lietal,1999;Yangetal,2004。
这种变性25s,65?
复性30s,72?
延伸90s,35个循
环,最后72?
延伸7min,涉及两个不同染色体上mRNA的剪接,即跨染色体
（）剪接interchromosomaltrans2splicing是一类特殊的Southern杂交:
探针为黄鳝的Dmrt1全长cD2
（）反式剪接,其分子机制及生物功能仍不清楚。
NA1148kb,GenBank登录号为AF421347,以本研究首次发现鸡DMRT1的跨染色体剪接,插入黄鳝Dmrt1全长cDNA的质粒为模板,PCR扩
（并且与多个染色体上基因发生多次剪接,我们称其增,切胶回收扩增片段E1Z1N1GelExtraction
）（为多重跨染色体剪接multipleinterchromosomalKit。
扩增探针引物:
5f2:
5′GTTTGGCAGTTG2
）trans2splicing。
这些新发现无疑有助于对在转录水GCAGCATAGT3′,1500r:
5′AGTTTGATTCTGAA2
GAGTGCCCC3′。
将克隆PCR产物电泳转膜,紫外后的序列分别是另外3个染色体上基因的跨染色体2（）胶联仪胶联2min12000J/cm。
55?
预杂交2剪接,它们分别是DMRT1与4号染色体上的32αh,2p标记的探针加入杂交管中于55?
杂交16（）CENPC1基因GenBank登录号nm205051、5号h。
依次用2×SSC、015%SDS;2×SSC、011%（染色体上CD5R基因预测基因,与CD5基因相
）洗膜,最后用011×SSC、011%?
SDS于55关,GenBank登录号hmm8859和2号染色体上SDS
（）37LRP/p40GenBank登录号xm418817基因,洗膜。
X射线曝光及显影。
115序列测序与分析由此构成了新的跨染色体剪接本,分别命名为DM2
DNA序列委托上海博亚公司测序,cDNA序列RT12CENPC1、DMRT12CD5R、DMRT1237LRP/
（p40GenBank登录号分别为AY448020、在NCBI进行Blast分析,查询与其相似的核苷酸序
）（）AY448021、AY448022。
上列,并在UCSChttp:
www1genome1ucsc1edu
利用Blat与鸡基因组序列进行比对分析。
DMRT2CENPC1含有4个外显子,最后一个
外显子是4号染色体上着丝粒蛋白CENPC1基因2结果与分析的外显子19,也是CENPC1基因的3′UTR。
DM2
RT12CD5R基因含有7个外显子,外显子4、5、6、211鸡DMRT13′RACE分析
7来自5号染色体上CD5R基因。
DMRT1237LRP/3′RACE分析获得920、860和810bp的DNA
（片段,经DMRT1探针Southern杂交为阳性图p40基因含有6个外显子,后4个外显子位于2号）（1。
经DNA序列测序和分析,与已报道的鸡DM2染色体上,与37LRP/p40基因核纤受体前体蛋
）（）RT1基因mRNAAF123456进行比对分析,发现白/p40核糖体关联蛋白基因相互剪接。
这3个克隆都包含DMRT1的保守区域DM区,但对3个剪接本翻译的氨基酸序列进行分析,发
现其开放阅读框与DMRT1基因的开放阅读框一3′端序列在DMRT1基因中并不存在。
对鸡基因组
进行Blast分析,发现存在选择性剪接。
DMRT1基致。
DMRT12CENPC1基因编码232个氨基酸,含因含有5个外显子,与之比较,3个剪接本都有外有DMRT1基因的DM区,来自于CENPC1基因的
显子1和2,但是缺少外显子4和5。
在3个剪接225个碱基仅提供19个氨基酸的编码序列,其余
为3′UTR。
DMRT12CD5R基因编码239个氨基酸,本中第一个剪接本含有完整的外显子3;第二个剪
含DM区,来自于CD5R基因的序列为CD5相关的第三个剪接接本含有外显子3前面的34个碱基;
一个转录本,该转录本由于其选择性剪接与CDR本完全不含外显子3。
其他转录本部分区段存在差异,导致3′端读码框出212鸡DMRT1存在跨染色体剪接
发现这三个剪与鸡基因组序列进行比对分析,现变化,而与DMRT1拼接后读码框一致。
DM2
（）接本存在跨染色体剪接图2。
在DMRT1序列之RT1237LRP/p40基因编码259个氨基酸,含DMRT1
图1鸡DMRT13′RACE分析
Fig.13′RACEanalysisofchickenDMRT1（）A:
克隆PCR产物;B:
PCR产物的Southern杂交结果A:
ClonePCRproducts;B:
SouthernblothybridizationofPCRproducts。
1:
DMRT2CENPC1;2:
DMRT12CD5R;3:
DMRT1237LRP/p40;4:
LambdaDNA/Hind?
+EcoR?
marker.
图2DMRT2CENPC1、DMRT12CD5R、DMRT1237LRP/p40的跨染色体分析
Fig.2Interchromosomaltrans2splicinganalysisofDMRT2CENPC1,DMRT12CD5R,
DMRT1237LRP/p40
（（（）））因目前鸡DMRT1mRNA的5′序列未到起始密码子ATG,依据人CAB8242711、小鼠AAF1282611、大鼠AAK5770611、（）猪AAL25080的DMRT1蛋白质序列,并假定鸡DMRT15′端不存在选择性剪接,预测了鸡DMRT1mRNA5′序列,将序列补至
ATG。
Becauseofunknown5′sequencetostartcodeATGofDMRT1mRNA,wededucedthe5′sequenceofchickenDMRT1accordingtoaminoacid
（）（）（）sequencesofmouseAAF1282611,ratAAK5770611,pigAAL25080,andsupposedthatnoalternativesplicingat5′regionofchick2enDMRT1.
DM区,其余氨基酸序列与37LRP/p40基因一致,,DMRT2CENPC1形成单股茎环结构,DMRT12构
包括37LRP/p40基因的回文序列LMWWML,该回CD5R和DMRT1237LRP/p40形成双股茎环结构。
（文序列是核纤蛋白受体?
的结合位点Clausseet3讨论）al,1996。
DMRT12CENPC1、DMRT12CD5R以
TGA为终止密码子,DMRT1237LRP/p40则采用DMRT1/dsx/mab23是惟一参与脊椎动物和非（）TAA表1;DMRT12CENPC1和DMRT1237LRP/脊椎动物性别决定与分化发育的共有基因,它们均p40含有AATAAA加尾信号,DMRT12CD5没有此具有共同的DM结构域。
目前已在哺乳类、鸟类、（序列,可能存在其他序列起加尾信号的作用图
爬行类两栖类和鱼类等进化地位不同的物种中都发）3。
DMRT12CD5R中两段染色体序列相剪接的附现了该类基因。
已知果蝇dsx基因的3′端选择性剪近序列存在8个碱基重叠,即CCATCCCC,DM2接参与其性别分化,最近我们在小鼠、黄鳝、斑马
RT1237LRP/p40中存在7个碱基重叠,即TGAGC2鱼DMRT1中发现的选择性剪接方式与果蝇dsx基
（）因类似Guoetal,2005;Huangetal,2005,表CA。
明这种剪接在进化上是保守的,可能在性别决定和213鸡DMRT1跨染色体剪接位点分析（分化机制中具有重要的作用Burtis&Baker,对这些剪接本的跨染色体剪接位点进行分析,）1989。
性腺的形成与分化是同时涉及生命现象中发现DMRT12CENPC1和DMRT1237LRP/p40均符两种细胞分裂形式的惟一发育过程,即有丝分裂和
合GU2AG规律,DMRT12CD5R是AT2CC,也不符减数分裂,相对其他生命过程,其分化发育中的基
因表达调控具有独特的复杂性。
合少见的GC2AG,AT2AC,可能是稀有的跨染色体
（）本研究发现鸡DMRT1存在跨染色体剪接,并剪接方式表1。
对跨染色体剪接位点附近的34
bp序列进行分析,发现它们的序列不具有保守性。
且分别与另外3个染色体的3个不同基因之间发生
（）用RNAStructureMathewsetal,1999预测二级结
表1鸡DMRT1及其跨染色体剪接位点分析
Tab.1SplicingsitesanalysisofchickenDMRT1andinterchromosomaltrans2splicedisoforms
剪接位点Splic
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