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1、分子生物学技术在病理学中的应用可编辑分子生物学技术在病理学中的应用 医学 1第三章分子生物学技术在病理学中的应用 医学 2第一节 原位分子杂交技术 in situ hybridization ,ISH 医学 3核酸分子杂交概述检测核酸分子间序列同源性的一种技术,主要根据核酸碱基互补的原则(C-G、A-T、A-U),用已知顺序的核酸片段DNA或RNA作为探针,经特殊标记后,与提纯的或组织、细胞中的靶核酸进行杂交,对其进行检测。核酸分子杂交可以在DNA-RNA、RNA-RNA、DNA-DNA之间进行。医学 4杂交类型按其作用方式大致分为固相杂交和液相杂交两种。液相杂交技术是指参加反应的两条核酸链都

2、游离在溶液;包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等 。医学 5固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上(常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜等),另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交(colony in situ hybridization)、斑点杂交法(Dot blot)、Southern印迹杂交(Southern blot)、Northern印迹杂交(Northern blot)和组织原位杂交(Tissue in situ hybridization),即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。医学 6原位分子杂交技术(I

3、n situ hybridization, ISH简称原位杂交,指应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体,然后再应用与标记物相应的检测系统,通过组化或免疫组化的方法在被测的核酸原位形成带颜色的杂交信号,在显微镜或电镜下显示出目的DNA或RNA在细胞内定位。医学 7可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、细胞印片、涂片上进行杂交,因此能结合病理形态的变化,检出细胞或组织中200-300拷贝以上的核酸序列。属于固相核酸分子杂交的范畴医学 8区别:菌落杂交系细菌裂解释放出DNA,然后进行杂交;Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特

4、定的基因片段,而Northern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。医学 9基本方法杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等;杂交;杂交后处理;显示:包括放射性自显影和非放射性标记的显色 ;对照实验和结果的判断 医学 10组织固定目的:形态结构;保存细胞内的DNA,RNA的水平;探针易于进入DNA稳定,mRNA相对稳定,而RNA则易被酶等降解;石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加,影响核酸探针的穿透,因而杂交信号常低于冰冻切片。 医学 11

5、常用固定剂1. 4%多聚甲醛磷酸缓冲液 最常用,不与蛋白质产生广泛交联,不会影响探针穿透入组织或细胞,较好的保留RNA;2. 3:1乙醇冰醋酸 增加探针的穿透性,但不能最大限度保存RNA,对组织有损伤;3. 戊二醛 较好保存RNA和组织形态,但与蛋白质产生广泛交联,影响探针的穿透性;医学 12玻片和组织切片的处理 盖片和载片应用热肥皂刷洗,自来水清洗干净后,置于清洁液中浸泡24h,清水洗净烘干,95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲洗、烘干,烘箱温度最好在150或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放 。粘附剂涂抹玻片医学 13增强组织的通透性和核酸探针的穿透

6、性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂或称清洗剂Triton X-100或某些消化酶如蛋白酶K、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶等。这种广泛的去蛋白作用无疑可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性,提高杂交信号,但会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态,在用量及孵育时间上应慎为掌握。医学 14减低背景染色 杂交后(Posthybridization )的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。 预杂交(Prehybridization)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的,从而减低背景染色。减低残留的

7、内源性的RNA医学 15防止RNA酶的污染手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温(240,最低温度必须在150左右)烘烤以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。 医学 16核酸分子杂交探针分子杂交是核酸链间依碱基配对规则的一种结合方式,是核酸的重要理化特性,利用分子杂交特性来对特定核酸序列进行检测,必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记,这条链称为核酸探针。医学 17核酸探针的类型根据标记方法可分为放射性和非放射性两类。放射性者有污染,显

8、影时间长等;非同位素标记,常用的有生物素、地高辛、5-BrdU嗅脱氧尿嘧啶核苷、荧光素等。非同位素标记操作方便,标记好的探针可以长期保存,随时取用,且实验时间短,结果可在光镜下观察。医学 18医学 19根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针(单链DNA和双链DNA ) 、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。cDNA (complementary DNA)探针:以RNA为模板,经逆转录酶催化按照RNA的核苷酸顺序合成DNA,这一途径与一般遗传信息的方向相反,故称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分子。医学 20医学 21 医学 22寡核苷酸探针近年应用较多的寡核苷酸探

9、针,常为20-30个碱基,分子量小,有利于探针进入细胞内,无须采取提高细胞通透性的措施。非克隆性DNA探针,在无cDNA的情况下,可根据已知文献发表的共同序列由DNA合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工合成。医学 23寡核苷酸探针制造方便,价格低廉,也可进行放射性与非放射性标记特异性不如克隆性探针强,亦不如其杂交信号高医学 24成套ISH试剂盒病毒系列EBV、HBV、HCV、HPV等癌基因系列(bcl-2、cyclinD1、nm23、P16、P21等)细胞因子系列EGF、bEGF 医学 25原位分子杂交实验步骤:(1)切片脱蜡入水(冰冻切片先用多聚甲醛固定);(2)PBS(0.1M)洗涤, 5

10、 分钟 1 次( RNA 杂交用DEPC水洗涤);(3)0.1N HCL,10分钟;(4)PBS洗涤3分钟2次;(5)蛋白酶K消化:(6)-(7)-医学 26杂交后处理包括系列不同浓度,不同温度的盐溶液的漂洗。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高,但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色,获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合,从而增强了背景染色。医学 27显示又称检测系统。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系

11、统进行不同显色处理。 医学 28对照实验和结果的判断常用的对照试验有下列几种。(1)将cDNA或cRNA探针进行预杂交吸收试验。(2)与非特异性载体序列和不相关探针杂交置换试验。(3)将切片应用RNA酶或DNA酶进行须处理后杂交。应用同义RNA探针进行杂交。(4)以不加核酸探针杂交液进行杂交空白试验。(5)组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。(6)应用未标记探针做杂交进行对照。医学 29荧光原位杂交荧光原位杂交fluorescence in situ hybridization, FISH是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧

12、光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子reporter molecule结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.医学 30FISH的基本原理是将DNA或RNA探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到DNA切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列,可对DNA定性、定位、相对定量分析 FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术。缺点:方法费时、价格昂贵,所需设备复杂并需特殊的照相机记录

13、暂时的信号及不能观察组织形态学等。医学 31CISH显色原位杂交法(Chromogenic in situ hybridization,CISH) 2000年Tanner首次报道了采用CISH法检测HER2基因扩增的可行性,研究显示CISH与FISH具有极强的一致性。高度特异性的地高辛标记探针进行原位杂交,传统的过氧化物酶显色反应染片过程,在普通光学显微镜下定量检测基因的扩增,操作简单,价格远较FISH低廉,且信号稳定,组织切片储藏方便,并可做组织学评价。 医学 32原位杂交的应用简介:特异性高;可以精确定位;能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究;不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的

14、靶序列有极高的敏感性;可完整地保持组织与细胞的形态。由定性进入定量,应用也更加广泛 。医学 33应用基础研究:如基因组团Gene mapping,转基因检测,基因表达定位,核DNA和mRNA的排列和运输、复制和细胞的分类等;临床研究:如细胞遗传学,产前诊断,肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。医学 341在肿瘤研究中的应用:(A).检测肿瘤组织中癌基因,抗癌基因的表达,以判断预后。如发现原癌基因C-myc在Burkitt 淋巴瘤,大肠癌,小细胞肺癌中有扩增;CerbB-2的扩增与乳癌淋巴结转移呈正相关。医学 35(B)检测肿瘤标志物mRNA,对肿瘤的早期诊断及治疗有重

15、要的意义。如检测人肝脏和癌旁肝细胞中AFPmRNA,在肝癌细胞及癌旁组织均发现了AFPmRNA,但癌组织中AFPmRNA阳性较均一,而癌旁肝中AFPmRNA阳性呈散在分布.医学 36医学 372组织、细胞中病毒DNA或RNA的检测在淋巴瘤细胞及鼻咽癌细胞中发现EBV , 在 肝 炎 、 肝 癌 细 胞 找 到HBVDNA,尤其是在原发性肝癌中其整合率可达90%;粥样硬化的主动脉内发现了单纯疱疹病毒;检测细菌,疟原虫等的核酸序列。医学 38医学 39医学 40医学 413细胞的生物合成及遗传疾病研究中的应用组织,细胞内mRNA可以反映组织合成某种蛋白质或多肽的能力,其敏感性要比直接测定蛋白质高1

16、000倍,以cDNA作为探针的ISH结合免疫组化技术,可以了解单个细胞内mRNA的翻译水平,即蛋白质合成能力,从而了解组织器官的代谢和功能状态,以及器官组织内不同细胞的功能差异,并能同时进行形态学观察。医学 42医学 43第二节聚合酶链反应polymerase chain reaction ,PCR医学 44聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction ,PCR80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从

17、一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 医学 45Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 1993年Mullis获得了诺贝尔化学奖 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段;1988年初,Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR; 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌the

18、rmus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 PCR技术简史 医学 46PCR原理 PCR实际上是以DNA为模板,在引物和4种核苷酸存在的条件下,在DNA聚合酶作用下出现的酶促合成反应。PCR最重要的组分是引物,是根据模板DNA的序列设计合成的两条20个核苷酸左右的寡核苷酸链,这两个引物分别特异性结合在模板DNA二条链的两侧(3?端)。医学 47反应体系:DNA模板,一种引物,四种三磷酸核苷,TaqDNA聚合酶及含 MgCL2的缓冲液。医学 48循环(1)变性denaturation:在95 左右,常规采用94,30秒-1分钟,在高温条件下使模板DNA解链为单链模板;(2)退火

19、annealing:在较低温度下,引物特异地结合到DNA模板上,温度在55 左右,时间30秒-1分钟;(3)延伸extension:在72 条件下,DNA聚合酶根据模板的序列,在引物的3端新合成的互补链不断延伸。根据模板的长度,延伸时间一般1-2分钟。医学 49医学 50医学 51医学 52PCR的反应动力学PCR反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=1+Xn计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指

20、数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期。 医学 53PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间,是需要扩增的特定片段短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的 医学 54分析与鉴定PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。常用方法如凝胶电泳分析、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶切分析、分子杂交(Southern印迹杂交、斑点杂交)、核酸序列分析等。医学 55PCR反应体系与反应条件(一)、标准的PCR反应体系: 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200

21、umol/L 引物 各10-100pmol 模板DNA 0.1-2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul医学 56PCR反应五要素:引物:PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 酶及浓度:浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。 dNTP: dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系, 模板:模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一? Mg2+ :Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 医学 57PCR常见类型1.逆转录PCRRT-PCR: RNA经逆转录后可

22、作为PCR的模板.,用来扩增RNA。2.竞争逆转录PCR C-RT-PCR :低丰度RNA定量的好方法。3.多重PCR(multiples PCR):在同一PCR体系中加入多对引物可用于基本长度很长,发生多处缺失的检测。扩增同一模板的几个区域。4.多种PCR:可同时加入多套以生物素标记的引物PCR反应。医学 585反向PCR(iverse polymerase chain reaction):对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。6不对称PCR:在PCR反应体系中,限制引物之一的浓度(50-100:1)进行扩增,可得到单链PCR产物,可用于制备单链测序模板或单链DNA杂交探针。

23、7锚定PCR(anchored polymerase chain reaction)8着色互补试验或荧光PCR9双温PCR(two-temperature PCR)医学 59PCR技术的应用研究:基因克隆;DNA测序;分析突变;基因重组与融合;鉴定与调控蛋白质结 合DNA序列;转座子插入位点的绘图;检测基因的修饰;合成基因的构建;构建克隆 或表达载体;检测某基因的内切酶多态性诊断:细菌螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌等;病毒HTLV、HIV、HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV,麻疹病毒、轮状病毒、细小病毒B19;寄生虫疟疾 等;人遗

24、传病地贫、血友病等免疫学:HLA分裂;T细胞受体或抗体多样化的定性;自身免疫病基因作图;淋 巴因子定量 医学 60人类基因组工程:用散布重复序列产生DNA标志;遗传图谱的构建检测DNA、 多态性或精子绘图;物理图谱的构建;测序,表达图谱法医:犯罪现场标本分析;HLA-DQ肿瘤:胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学:遗传聚类研究;动物保护研究;生态学;环境科学;实验遗 传学。古生物学:考古与博物馆标本分析动物学:动物传染病的诊断等植物学:检测植物病原等PCR技术的应用医学 61病理学中应用的PCR种类:(1)普通PCR:对病理档案资料进行回顾性研究。因普通PCR是

25、将核酸提取后再进行扩增,无法明确样本DNA的定位。医学 62(2)原位PCRHasse等于1990年建立的技术 原位PCR是保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增, 在扩增剂中掺入示踪剂,或扩增后再作原位杂交,用该法检测细胞内单拷贝基因片段比单用原位杂交的敏感性有极大的提高。不但可以检测到靶DNA,而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中,更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。 医学 63原位PCR检测宫颈组织中HPV 16-DNA (阳性细胞核为黑色) 免疫组化检测细胞角蛋白(棕黄色) 医学 64医学 65(3)逆转录PCR(ret

26、rotranscription PCR,RT-PCR)以RNA为模板,经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA,以cDNA链为模板进行的PCR反应。常用新鲜组织或细胞提取的RNA经逆转录酶作用后合成互补DNA(cDNA),再以此cDNA为模板进行扩增,以检测组织,细胞内特定基因的表达或检测病人标本中的RNA病毒。医学 66医学 67(1)检测外源性基因片段, 病毒性,寄生虫性及细菌性疾病的诊断,提高检出率,集中在病毒感染的检查上;在特殊染色,免疫组化或原位杂交阴性的组织中PCR检测可获阳性结果,如结核杆菌,如 HIV 、 HPV 、 HBV 、CMV, EB病毒,疟原虫,弓形虫等。PCR在

27、病理学中的应用医学 68病原微生物的检测可根据病原体的基因序列,选择特异的顺序作为PCR引物,后检测是否有PCR产物而测知病原体的存在。观察病原体在体内分布规律。医学 69(2)内源性基因片段,如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。医学 70A)癌基因的研究:如用PCR方法发现在胰腺癌,结肠癌,甲状腺癌等标本中有ras基因的突变,且ras基因的突变与肿瘤发生的早期阶段有关。在结肠,直肠息肉和癌旁组织中发现C-myc-mRNA的表达水平明显增高,其表达水平与肿瘤组织学分型和体积大小明显有关,和结肠,直肠息肉的恶性潜力有关。肿瘤的诊断和研究医学 71B)抗癌基

28、因的研究肺癌,结肠癌和乳腺癌等P53抗癌基因点突变而灭活视网膜母细胞瘤的发生关键是患者抗癌基因Rb的缺失或点突变,使细胞不能产生具有正常功能的蛋白,或形成无功能蛋白产物。医学 72C)肿瘤相关病毒基因的检测可检测宫颈癌,肝癌,鼻咽癌等与病毒密切相关的肿瘤中病毒在细胞基因中整合状态和其位点,研究病毒和肿瘤的关系,为肿瘤的防止提供理论依据 ;医学 73D)其他肿瘤的早期诊断和筛检原位杂交技术在肝癌细胞和癌旁细胞中均发现了AFPmRNA,在癌组织中AFPmRNA阳性细胞分布均一,而在癌旁组织则中则呈散在分布。另外发现HBV DNA与AFPmRNA可同时出现于肝硬变组织肝细胞内,提示HBV感染与AFP

29、基因活跃表达有关,亦为研究HBV、AFP、肝硬变与肝癌的关系提供了科学依据。 医学 74(2)肿瘤疗效监测肿瘤细胞产生多药耐药性(multid rug resistance,MDR),MDR细胞中有种特异mRNA,转录这种mRNA的基因为MDR基因,细胞中MDR的mRNA含量越多,细胞的耐药性就越强。 MDR的mRNA含量低的白血病患者容达到缓解,并且可以较长时间维持完全缓解,若化疗过程中MDR mRNA逐渐升高,化疗反应会逐渐不敏感。 医学 75(3)检测导入基因在转基因动物、器官移植、基因治疗等过程中,原位PCR技术可用于研究外源基因导入机体后与受体细胞之间的相互作用关系。Yoshioka T等将绿色荧光蛋白基因插入干细胞基因组,随后采用原位PCR技术与荧光显微镜分析干细胞移植后在受体中的生长发育情况。 医学 76(4) 遗传病基因检测镰刀状红细胞贫血是珠蛋白基因的点突变所致,可将PCR产物与特异性探针进行斑点杂交而加以证实,对少量羊水细胞或绒毛进行检测,即可达到产前诊断的目的 -地中海贫血医学 77生物芯片 苏州大学医学部 邓敏医学 78一、何为生物芯片 一般说来,生物芯片就是在一块厘米见方的玻璃片、硅片、塑料膜等材料上,通过特殊的表面化学处理连接上相关的生物分子,经过特殊设计的生物化学反应,然后由专用的仪器收集检测信号,再用计算机