分子生物学技术在病理学中的应用可编辑.docx
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分子生物学技术在病理学中的应用可编辑
分子生物学技术在病理学中的应用
医学1
第三章
分子生物学技术
在病理学中的应
用
医学2第一节原位分子杂交技术insitu
hybridization,ISH
医学3
核酸分子杂交概述检测核酸分子间序列同源性的一种
技术,主要根据核酸碱基互补的原
则（C-G、A-T、A-U）,用已知顺序
的核酸片段DNA或RNA作为探针,
经特殊标记后,与提纯的或组织、
细胞中的靶核酸进行杂交,对其进
行检测。
核酸分子杂交可以在DNA-RNA、
RNA-RNA、DNA-DNA之间进行。
医学4
杂交类型按其作用方式大致分为固相杂交和
液相杂交两种。
液相杂交技术是指参加反应的两条
核酸链都游离在溶液;包括吸附杂
交、发光液相杂交、液相夹心杂交
和复性速率液相分子杂交等。
医学5固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定
在固体的支持物上（常用的有硝酸纤维素
滤膜,其它如尼龙膜等）,另一条参加反
应的核酸链游离在溶液中。
固相杂交有菌落原位杂交（colonyinsitu
hybridization）、斑点杂交法（Dotblot）、
Southern印迹杂交（Southernblot）、
Northern印迹杂交（Northernblot）和组
织原位杂交（Tissueinsitu
hybridization）,即原位杂交组织化学技
术和原位杂交免疫细胞化学技术。
医学6
原位分子杂交技术
（Insituhybridization,ISH简称原位杂交,指应用已知碱基顺
序并带有标记物的核酸探针与组织、
细胞中待检测的核酸按碱基配对的
原则进行特异性结合而形成杂交体,
然后再应用与标记物相应的检测系
统,通过组化或免疫组化的方法在
被测的核酸原位形成带颜色的杂交
信号,在显微镜或电镜下显示出目
的DNA或RNA在细胞内定位。
医学7可以在组织的石蜡切片、冰冻切片、
细胞印片、涂片上进行杂交,因此
能结合病理形态的变化,检出细胞
或组织中200-300拷贝以上的核酸序
列。
属于固相核酸分子杂交的范畴
医学8区别:
菌落杂交系细菌裂解释放出
DNA,然后进行杂交;Southern印
迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定
的基因片段,而Northern印迹杂交
法是用以检测某一特定的RNA片段
的。
它们都只能证明该病原体、细
胞或组织中是否存在待测的核酸而
不能证明该核酸分子在细胞或组织
中存在的部位。
医学9
基本方法①杂交前准备,包括固定、取材、玻片和
组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、
减低背景染色等;②杂交;③杂交后处理;④显示:
包括放射性自显影和非放射性标
记的显色;⑤对照实验和结果的判断
医学10
组织固定目的:
形态结构;保存细胞内的DNA,
RNA的水平;探针易于进入DNA稳定,mRNA相对稳定,而RNA则
易被酶等降解;石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增
加,影响核酸探针的穿透,因而杂交信号
常低于冰冻切片。
医学11
常用固定剂1.4%多聚甲醛磷酸缓冲液最常用,不与
蛋白质产生广泛交联,不会影响探针穿透
入组织或细胞,较好的保留RNA;2.3:
1乙醇冰醋酸增加探针的穿透性,但
不能最大限度保存RNA,对组织有损伤;3.戊二醛较好保存RNA和组织形态,但与
蛋白质产生广泛交联,影响探针的穿透
性;
医学12
玻片和组织切片的处理盖片和载片应用热肥皂刷洗,自来水清洗
干净后,置于清洁液中浸泡24h,清水洗
净烘干,95%酒精中浸泡24h后蒸馏水冲
洗、烘干,烘箱温度最好在150℃或以上
过夜以去除任何RNA酶。
盖玻片在有条件
时最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存
放。
粘附剂涂抹玻片
医学13
增强组织的通透性和核酸探针的
穿透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂
或称清洗剂TritonX-100或某些消化酶如
蛋白酶K、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉
酶等。
这种广泛的去蛋白作用无疑可增强
组织的通透性和核酸探针的穿透性,提高
杂交信号,但会减低RNA的保存量和影响
组织结构的形态,在用量及孵育时间上应
慎为掌握。
医学14
减低背景染色杂交后（Posthybridization）的酶处理和
杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。
预杂交（Prehybridization）是减低背景
染色的一种有效手段。
预杂交液和杂交液
的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖将
组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特
异性杂交点的目的,从而减低背景染色。
减低残留的内源性的RNA
医学15
防止RNA酶的污染手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有
RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在
整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。
所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前
一日置高温（240℃,最低温度必须在
150℃左右）烘烤以达到消除RNA酶的目
的。
杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压
消毒处理。
医学16
核酸分子杂交探针分子杂交是核酸链间依碱基配对
规则的一种结合方式,是核酸的
重要理化特性,利用分子杂交特
性来对特定核酸序列进行检测,
必须将杂交链中的一条用某种可
以检测的分子进行标记,这条链
称为核酸探针。
医学17
核酸探针的类型根据标记方法可分为放射性和非放射
性两类。
放射性者有污染,显影时间长等;非同位素标记,常用的有生物素、地
高辛、5-BrdU嗅脱氧尿嘧啶核苷、
荧光素等。
非同位素标记操作方便,标记好的探
针可以长期保存,随时取用,且实验
时间短,结果可在光镜下观察。
医学18
医学19根据探针的核酸性质不同可分为
DNA探针（单链DNA和双链
DNA）、RNA探针、cDNA探针、
cRNA探针和寡核苷酸探针等。
cDNA（complementaryDNA）探
针:
以RNA为模板,经逆转录酶催
化按照RNA的核苷酸顺序合成DNA,
这一途径与一般遗传信息的方向相
反,故称逆转录。
cDNA是指互补
于mRNA的DNA分子。
医学20
医学21
医学22
寡核苷酸探针近年应用较多的寡核苷酸探针,常为20-
30个碱基,分子量小,有利于探针进入细
胞内,无须采取提高细胞通透性的措施。
非克隆性DNA探针,在无cDNA的情况下,
可根据已知文献发表的共同序列由DNA合
成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工合
成。
医学23
寡核苷酸探针制造方便,价格低廉,也可进行放
射性与非放射性标记特异性不如克隆性探针强,亦不如
其杂交信号高
医学24
成套ISH试剂盒病毒系列EBV、HBV、HCV、HPV
等癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、
nm23、P16、P21等）细胞因子系列EGF、bEGF
医学25
原位分子杂交实验步骤:
（1）切片脱蜡入水（冰冻切片先用
多聚甲醛固定）;
（2）PBS（0.1M）
洗涤,5分钟1次（RNA杂交用
DEPC水洗涤）;（3）0.1NHCL,
10分钟;（4）PBS洗涤3分钟2次;
（5）蛋白酶K消化:
（6）---（7）-
----
医学26
杂交后处理包括系列不同浓度,不同温度的盐溶液的
漂洗。
RNA探针杂交时产生的背景染色特别高,
但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染
色,获得较好的反差效果。
在杂交后漂洗
中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基
配对RNA除去。
一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到
低而温度由低到高。
切勿使切片干燥。
干燥的切片即使大量的
溶液漂洗也很难减少非特异性结合,从而
增强了背景染色。
医学27
显示又称检测系统。
根据核酸探针标记物的种类分别进
行放射自显影或利用酶检测系统进
行不同显色处理。
医学28
对照实验和结果的判断常用的对照试验有下列几种。
（1）将cDNA或cRNA探针进行预杂交吸
收试验。
（2）与非特异性载体序列和不相关探针
杂交置换试验。
（3）将切片应用RNA酶或DNA酶进行须
处理后杂交。
应用同义RNA探针进行杂交。
（4）以不加核酸探针杂交液进行杂交空
白试验。
（5）组织对照用已知确定为阳性或阴性组
织进行杂交对照。
（6）应用未标记探针做杂交进行对照。
医学29
荧光原位杂交荧光原位杂交fluorescenceinsitu
hybridization,FISH是在20世纪80
年代末在放射性原位杂交技术的基
础上发展起来的一种非放射性分子
细胞遗传技术,以荧光标记取代同位
素标记而形成的一种新的原位杂交
方法,探针首先与某种介导分子
reportermolecule结合,杂交后再
通过免疫细胞化学过程连接上荧光
染料.
医学30FISH的基本原理是将DNA或RNA探针用
特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂
交到DNA切片上,再用与荧光素分子偶联的
单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测
DNA序列,可对DNA定性、定位、相对定
量分析FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能
长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不
但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同
时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色
荧光原位杂交技术。
缺点:
方法费时、价格昂贵,所需设备复
杂并需特殊的照相机记录暂时的信号及不
能观察组织形态学等。
医学31
CISH显色原位杂交法（Chromogenicinsitu
hybridization,CISH）2000年Tanner首次报道了采用CISH
法检测HER2基因扩增的可行性,研究显
示CISH与FISH具有极强的一致性。
高度特异性的地高辛标记探针进行原位
杂交,传统的过氧化物酶显色反应染片
过程,在普通光学显微镜下定量检测基
因的扩增,操作简单,价格远较FISH
低廉,且信号稳定,组织切片储藏方便,
并可做组织学评价。
医学32
原位杂交的应用简介:
特异性高;可以精确定位;能在成
分复杂的组织中进行单一细胞的研
究;不需要从组织中提取核酸,对
于组织中含量极低的靶序列有极高
的敏感性;可完整地保持组织与细
胞的形态。
由定性进入定量,应用也更加广泛。
医学33
应用基础研究:
如基因组团Gene
mapping,转基因检测,基因表达
定位,核DNA和mRNA的排列和运
输、复制和细胞的分类等;临床研究:
如细胞遗传学,产前诊
断,肿瘤和传染性疾病的诊断,生
物学剂量测定和病毒学的病原学诊
断等。
医学34
1在肿瘤研究中的应用:
（A）.检测肿瘤组织中癌基因,抗癌基因
的表达,以判断预后。
如发现原癌基因C-
myc在Burkitt淋巴瘤,大肠癌,小细胞肺
癌中有扩增;CerbB-2的扩增与乳癌淋巴
结转移呈正相关。
医学35（B）检测肿瘤标志物mRNA,对肿瘤的早
期诊断及治疗有重要的意义。
如检测人肝
脏和癌旁肝细胞中AFPmRNA,在肝癌细
胞及癌旁组织均发现了AFPmRNA,但癌
组织中AFPmRNA阳性较均一,而癌旁肝
中AFPmRNA阳性呈散在分布.
医学36
医学37
2组织、细胞中病毒DNA或RNA
的检测在淋巴瘤细胞及鼻咽癌细胞中发现
EBV,在肝炎、肝癌细胞找到
HBVDNA,尤其是在原发性肝癌中
其整合率可达90%;粥样硬化的主动脉内发现了单纯疱
疹病毒;检测细菌,疟原虫等的核酸序列。
医学38
医学39
医学40
医学41
3细胞的生物合成
及遗传疾病研究中的应用组织,细胞内mRNA可以反映组织合成某
种蛋白质或多肽的能力,其敏感性要比直
接测定蛋白质高1000倍,以cDNA作为探
针的ISH结合免疫组化技术,可以了解单
个细胞内mRNA的翻译水平,即蛋白质合
成能力,从而了解组织器官的代谢和功能
状态,以及器官组织内不同细胞的功能差
异,并能同时进行形态学观察。
医学42
医学43
第二节
聚合酶链反应
polymerasechainreaction,
PCR
医学44
聚合酶链反应Polymerase
ChainReaction,PCR80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
特异、敏感、产率高、快速、简便、重复
性好、易自动化等突出优点;能在一个试
管内将所要研究的目的基因或某一DNA片
段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉
眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一
滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA
供分析研究和检测鉴定。
过去几天几星期
才能做到的事情,用PCR几小时便可完成。
PCR技术是生物医学领域中的一项革命性
创举和里程碑。
医学45Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的
设想1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室
的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合
酶链反应。
1993年Mullis获得了诺贝尔化
学奖Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌
DNA聚合酶I的Klenow片段;1988年初,
Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR;
1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜
热杆菌thermusaquaticus中提取到一种
耐热DNA聚合酶。
PCR技术简史
医学46
PCR原理PCR实际上是以DNA为模板,在引物和4
种核苷酸存在的条件下,在DNA聚合酶作
用下出现的酶促合成反应。
PCR最重要的组分是引物,是根据模板
DNA的序列设计合成的两条20个核苷酸
左右的寡核苷酸链,这两个引物分别特异
性结合在模板DNA二条链的两侧（3’?
端）。
医学47反应体系:
DNA模板,一种引物,四种三
磷酸核苷,TaqDNA聚合酶及含MgCL2
的缓冲液。
医学48
循环
（1）变性denaturation:
在95℃左右,
常规采用94℃,30秒-1分钟,在高温条件
下使模板DNA解链为单链模板;
（2）退火annealing:
在较低温度下,
引物特异地结合到DNA模板上,温度在55
℃左右,时间30秒-1分钟;（3）延伸extension:
在72℃条件下,
DNA聚合酶根据模板的序列,在引物的3’
端新合成的互补链不断延伸。
根据模板的
长度,延伸时间一般1-2分钟。
医学49
医学50
医学51
医学52
PCR的反应动力学PCR反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=1+Xn
计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,
X表示平均每次的扩增效率,n代表循环次
数。
平均扩增效率的理论值为100%,反应初
期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,
随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA
片段不再呈指数增加,而进入线性增长期
或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应
称平台期。
医学53
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两
部分。
短产物片段的长度严格地限定在两
个引物链5’端之间,是需要扩增的特
定片段短产物片段和长产物片段是由于引
物所结合的模板不一样而形成的
医学54
分析与鉴定PCR产物的分析,可依据研究对象
和目的不同而采用不同的分析方法。
常用方法如凝胶电泳分析、琼脂糖
凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、
酶切分析、分子杂交（Southern印
迹杂交、斑点杂交）、核酸序列分
析等。
医学55
PCR反应体系与反应条件
（一）、标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10-100pmol
模板DNA0.1-2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
Mg2+1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
医学56
PCR反应五要素:
引物:
PCR特异性反应的关键,PCR产物
的特异性取决于引物与模板DNA互补的程
度。
酶及浓度:
浓度过高可引起非特异性扩增,
浓度过低则合成产物量减少。
dNTP:
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效
率有密切关系,模板:
模板核酸的量与纯化程度,是PCR
成败与否的关键环节之一?
Mg2+:
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量
有显著的影响
医学57
PCR常见类型1.逆转录PCRRT-PCR:
RNA经逆转
录后可作为PCR的模板.,用来扩增RNA。
2.竞争逆转录PCRC-RT-PCR:
低丰
度RNA定量的好方法。
3.多重PCR（multiplesPCR）:
在同
一PCR体系中加入多对引物可用于基本长
度很长,发生多处缺失的检测。
扩增同一
模板的几个区域。
4.多种PCR:
可同时加入多套以生物素
标记的引物PCR反应。
医学585反向PCR（iversepolymerasechain
reaction）:
对一个已知的DNA片段两
侧的未知序列进行扩增和研究。
6不对称PCR:
在PCR反应体系中,限制
引物之一的浓度（50-100:
1）进行扩增,
可得到单链PCR产物,可用于制备单链测
序模板或单链DNA杂交探针。
7锚定PCR（anchoredpolymerase
chainreaction）8着色互补试验或荧光PCR9双温PCR（two-temperaturePCR）
医学59
PCR技术的应用研究:
基因克隆;DNA测序;分析突变;基因重
组与融合;鉴定与调控蛋白质结合DNA序列;转
座子插入位点的绘图;检测基因的修饰;合成基
因的构建;构建克隆或表达载体;检测某基因的
内切酶多态性诊断:
细菌螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、
立克次氏体、白喉杆菌、致病大肠杆菌、痢疾杆
菌等;病毒HTLV、HIV、HBV、HPVS、EV、
CMV、EBV、HSV,麻疹病毒、轮状病毒、细小
病毒B19;寄生虫疟疾等;人遗传病地贫、血
友病等免疫学:
HLA分裂;T细胞受体或抗体多样化的定
性;自身免疫病基因作图;淋巴因子定量
医学60人类基因组工程:
用散布重复序列产生DNA标
志;遗传图谱的构建检测DNA、多态性或精子
绘图;物理图谱的构建;测序,表达图谱法医:
犯罪现场标本分析;HLA-DQ肿瘤:
胰癌、结肠癌、肺癌、甲状腺癌、黑色素
瘤、血液恶性肿瘤组织和群体生物学:
遗传聚类研究;动物保护研
究;生态学;环境科学;实验遗传学。
古生物学:
考古与博物馆标本分析动物学:
动物传染病的诊断等植物学:
检测植物病原等
PCR技术的应用
医学61
病理学中应用的PCR种类:
（1）普通PCR:
对病理档案资料进
行回顾性研究。
因普通PCR是将核酸提取后再进行
扩增,无法明确样本DNA的定位。
医学62
（2）原位PCRHasse等于1990年建立的技术原位PCR是保持细胞或组织的完整性,使
PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细
胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增,
在扩增剂中掺入示踪剂,或扩增后再作原
位杂交,用该法检测细胞内单拷贝基因片
段比单用原位杂交的敏感性有极大的提高。
不但可以检测到靶DNA,而且还可以了解
靶DNA存在于何种细胞中,更有利于探讨
靶DNA与细胞之间的关系。
医学63
原位PCR检测宫颈组织中HPV16-DNA
（阳性细胞核为黑色）
免疫组化检测细胞角蛋白（棕黄色）
医学64
医学65
（3）逆转录PCR
（retrotranscriptionPCR,RT-PCR）以RNA为模板,经逆转录获得与RNA互
补的DNA链即cDNA,以cDNA链为模板
进行的PCR反应。
常用新鲜组织或细胞提取的RNA经逆转录
酶作用后合成互补DNA（cDNA）,再以
此cDNA为模板进行扩增,以检测组织,
细胞内特定基因的表达或检测病人标本中
的RNA病毒。
医学66
医学67
（1）检测外源性基因片段,病毒性,
寄生虫性及细菌性疾病的诊断,提高检
出率,集中在病毒感染的检查上;在特殊染色,免疫组化或原位杂交阴性
的组织中PCR检测可获阳性结果,如
结核杆菌,如HIV、HPV、HBV、
CMV,EB病毒,疟原虫,弓形虫等。
PCR在病理学中的应用
医学68
病原微生物的检测可根据病原体的基因序列,选择特
异的顺序作为PCR引物,后检测是
否有PCR产物而测知病原体的存在。
观察病原体在体内分布规律。
医学69
（2）内源性基因片段,如人体
的单基因病、重组基因、易位的
染色体、Ig的mRNA片段、癌基
因片段等。
医学70A）癌基因的研究:
如用PCR方法发
现在胰腺癌,结肠癌,甲状腺癌等标
本中有ras基因的突变,且ras基因的
突变与肿瘤发生的早期阶段有关。
在
结肠,直肠息肉和癌旁组织中发现C-
myc-mRNA的表达水平明显增高,其
表达水平与肿瘤组织学分型和体积大
小明显有关,和结肠,直肠息肉的恶
性潜力有关。
肿瘤的诊断和研究
医学71
B）抗癌基因的研究肺癌,结肠癌和乳腺癌等P53抗癌基
因点突变而灭活视网膜母细胞瘤的发生关键是患者
抗癌基因Rb的缺失或点突变,使细
胞不能产生具有正常功能的蛋白,
或形成无功能蛋白产物。
医学72
C）肿瘤相关病毒基因的检
测可检测宫颈癌,肝癌,鼻咽癌等与
病毒密切相关的肿瘤中病毒在细胞
基因中整合状态和其位点,研究病
毒和肿瘤的关系,为肿瘤的防止提
供理论依据;
医学73
D）其他肿瘤的早期诊断和筛检原位杂交技术在肝癌细胞和癌旁细胞中均
发现了AFPmRNA,在癌组织中
AFPmRNA阳性细胞分布均一,而在癌旁
组织则中则呈散在分布。
另外发现HBV
DNA与AFPmRNA可同时出现于肝硬变组
织肝细胞内,提示HBV感染与AFP基因活
跃表达有关,亦为研究HBV、AFP、肝硬
变与肝癌的关系提供了科学依据。
医学74
（2）肿瘤疗效监测肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrug
resistance,MDR）,MDR细胞中有种特异
mRNA,转录这种mRNA的基因为MDR
基因,细胞中MDR的mRNA含量越多,
细胞的耐药性就越强。
MDR的mRNA含
量低的白血病患者容达到缓解,并且可以
较长时间维持完全缓解,若化疗过程中
MDRmRNA逐渐升高,化疗反应会逐渐
不敏感。
医学75
（3）检测导入基因在转基因动物、器官移植、基因治
疗等过程中,原位PCR技术可用于
研究外源基因导入机体后与受体细
胞之间的相互作用关系。
YoshiokaT等将绿色荧光蛋白基因
插入干细胞基因组,随后采用原位
PCR技术与荧光显微镜分析干细胞
移植后在受体中的生长发育情况。
医学76
（4）遗传病基因检测镰刀状红细胞贫血是珠蛋白基因的
点突变所致,可将PCR产物与特异
性探针进行斑点杂交而加以证实,
对少量羊水细胞或绒毛进行检测,
即可达到产前诊断的目的β-地中海贫血
医学77
生物芯片
苏州大学医学部邓敏
医学78
一、何为生物芯片一般说来,生物芯片就是在一块厘
米见方的玻璃片、硅片、塑料膜等
材料上,通过特殊的表面化学处理
连接上相关的生物分子,经过特殊
设计的生物化学反应,然后由专用
的仪器收集检测信号,再用计算机
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